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Rev Cubana End 1999;10(1):8-15
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Trabajos Originales

Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biológicas (CIEB)

Especies reactivas de oxígeno en la diabetes mellitus con retinopatía diabética y sin ella

Lic. Mercedes Mamposo Solano,1 Dra. Olga S. León Fernández,2 Dr. Manuel E. Licea Puig,3 Lic. Beatriz Pérez Mesa4 y Lic. Rubén Castillo Jiménez5

Resumen

Con el objetivo de estudiar la relación entre las especies reactivas de oxígeno y la diabetes mellitus, complicada o no con retinopatía diabética, se realizó un estudio transversal en 20 pacientes insulinodependientes que fueron distribuidos en 2 grupos: I) compuesto por 11 sujetos sin retinopatía diabética y; II) constituido por 9 pacientes con retinopatía diabética. Se incluyó además, un grupo control formado por 12 sujetos voluntarios sanos. Se obtuvo, de todos los pacientes, una muestra de sangre venosa después de 12 h de ayuno, para determinar glucemia, superóxido dismutasa, glutatión reducido, catalasa y malonildialdehído. En ambos grupos de diabéticos, la actividad del superóxido dismutasa y los niveles del glutatión reducido estuvieron disminuidos (p < 0,05), mientras que la actividad de la catalasa y los niveles de malonildialdehído se hallaban significativamente elevados, en todos los casos, con respecto al grupo control. Se sugirió que las especies reactivas de oxígeno provocan un estrés oxidativo en los pacientes insulinodependientes y en particular, en los que presentan retinopatía diabética.

Descriptores DeCS: ESPECIES DE OXIGENO REACTIVO; DIABETES MELLITUS INSULINODEPENDIENTE; RETINOPATIA DIABETICA; ESTRES OXIDATIVO.

La diabetes mellitus (DM) es un síndrome crónico no curable con los medios disponibles en la actualidad. Se caracteriza por una pérdida de la homeostasis de la glucosa, lo cual también implica trastornos en el metabolismo de los lípidos y las proteínas. Sus síntomas causan limitaciones en el modo de vida de los pacientes y en muchos de ellos, el desarrollo de complicaciones crónicas que pueden llevarlos a la invalidez o a la muerte.

Existen evidencias de que los radicales libres (RL) (átomos, iones y moléculas con uno o más electrones impareados en el orbital más externo) están implicados en la patogenia de varias enfermedades en el hombre, un ejemplo lo constituye el síndrome diabético y sus complicaciones.1-3 Se ha comprobado que las células b de los islotes de Langerhans pancreáticos son altamente sensibles a la acción de estos agentes, al poseer el más bajo potencial secuestrador de especies reactivas derivadas de la reducción parcial del oxígeno molecular (EROs). Nerup y otros4 plantean que los RL desempeñan una función importante en la destrucción de las células b del páncreas en la DM dependiente de insulina (DMDI).5,6

Entre las complicaciones crónicas de la DM, las microangiopáticas son las más frecuentes y las que mayores secuelas ocasionan en los enfermos. Entre ellas se encuentra, la retinopatía diabética (RD), la cual constituye la causa de ceguera en el 0,2 % de los pacientes diabéticos anualmente. Esta es una enfermedad progresiva, que tiene como factores de riesgo más importantes, su tiempo de evolución y el descontrol glucémico. En la literatura aparecen trabajos que reportan niveles significativamente elevados de lipoperóxidos plasmáticos en pacientes con RD.

La disfunción endotelial dependiente de la vasodilatación ha sido comprobada tanto en diabéticos tipo I como tipo II. Este efecto de la hiperglucemia puede ser revertido por un número de antioxidantes, que incluye: superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y glutatión reducido (GSH). Se ha comprobado que los radicales libres pueden desempeñar una función importante en la patogenia de las complicaciones vasculares de la DM, a través de los mecanismos siguientes:7

  1. Autoxidación de la glucosa y generación de RL derivados del oxígeno.
  2. Niveles elevados de RL se han encontrado en eritrocitos, plasma y retina de animales y pacientes diabéticos, lo que se correlaciona con el control metabólico.
  3. Todos los antioxidantes endógenos se encuentran disminuidos en los tejidos y en la sangre del diabético.
  4. El tratamiento con diferentes antioxidantes puede mejorar muchas de las anormalidades metabólicas observadas en el paciente diabético.
En este trabajo nos proponemos estudiar la asociación de las EROs en la DMDI con RD y sin ella.

Métodos

Realizamos un estudio transversal en 20 pacientes diabéticos, mayores de 15 años, procedentes de la Clínica de Atención al Diabético del Instituto Nacional de Endocrinología. Los pacientes fueron divididos en 2 grupos: I) 11 pacientes con DMDI sin RD y II) 9 pacientes con DMDI con RD. Se incluyó en el estudio un grupo control constituido por 12 sujetos voluntarios sanos, con un intervalo de edad comprendido entre 18 y 30 años. No incluimos en este estudio a los diabéticos que utilizaban, como tratamiento, medicamentos capaces de modificar por sí mismos la respuesta oxidativa.

De todos los pacientes obtuvimos una muestra de sangre venosa después de 12 h de ayuno y antes de la administración de la insulina, para la determinación plasmática de glucemia, SOD, GSH, CAT y malonildialdehído (MDA). Determinanos la glucemia en un autoanalizador MT-II (Vital Scientific, Holandés) por el método de la xantina oxidasa;8 la SOD, por el método de inhibición de la autoxidación del pirogalol al radical superóxido en medio básico;9 el GSH, colorimétricamente;10 la CAT, por el método de la variación de la densidad óptica, utilizando como sustrato el peróxido de hidrógeno11 y el MDA, por el método del ácido tiobarbitúrico.12 En todos los casos determinamos el índice de masa corporal (IMC) por la fórmula siguiente: peso (kg)/ talla (m2). Para el estudio del fondo de ojo empleamos un oftalmoscopio de precisión (Carl Zeiss de Jena, Alemán) y clasificamos las lesiones de acuerdo con los criterios de L´Esperance.13

Con el objetivo de comparar los grupos en estudio utilizamos un Anova de clasificación simple y para la comparación múltiple, la prueba de Student-Newman Keuls, en los casos de parámetros con distribución normal. En el caso no paramétrico empleamos la prueba de Kruskal Wallis y la de Mann-Whitney; para determinar el grado de asociación entre las variables de estudio, un análisis de regresión y correlación.

Resultados

En la tabla mostramos las características generales y los parámetros bioquímicos de la muestra poblacional, donde el promedio de edad para ambos grupos fue similar, la duración de la DM fue significativamente mayor (p < 0,05) en los diabéticos con RD al compararlos con los que no la tenían, los pacientes de ambos grupos eran normopesos y los valores de glucemia estuvieron dentro de los intervalos clasificados como bien y regular (< 10 mmol/L).

TABLA. Características generales y valores de los indicadores bioquímicos de la muestra poblacional

 
Control
DMDI sin RD
DMDI con RD
 
(n = 12)
(n = 11)
(n = 9)
Edad (años)      
± DE)
28,2 ± 4,2
31,8 ± 21,8
31,6 ± 12,7
Sexo (M/F)
7/5
6/5
4/5
Duración de la DM      
(años) ( ± DE)
-
8,09 ± 6,4*
22,1 ± 7,4**
IMC (kg/m2)      
± DE)
22,3 ± 1,4
20,8 ± 2,6
23,4 ± 3,3
Glucemia (mmol/L)      
± DE)
6,4 ± 1,2
8,1 ± 1,3
8,8 ± 1,7*
SOD (U/L/min)      
± DE)
34,5 ± 9,2
17,9 ± 8,8*
12,5 ± 8,6*
GSH (mg/dL)      
± DE)
26,1 ± 5,4
5,6 ± 4,1*
2,5 ± 1,4*
Catalasa (U/L/min)      
± DE)
426,2 ± 215,3
954,5 ± 359,4*
1 174,6 ± 484,7*
MDA (nmol/L)      
± DE)
603,3 ± 148,3
946,9 ± 293,3*
1 754,9 ± 1 103,3**
* vs. control p < 0,05; *vs.** p < 0,05.

La actividad de la enzima SOD estuvo disminuida significativamente (p < 0,05) en ambos grupos de diabéticos, independientemente de la presencia o no de RD, al compararlos con el grupo control (fig. 1).

Figura 1
FIG. 1. Actividad de la enzima superóxido dismutasa.

Los niveles de GSH se hallaron disminuidos significativamente (p < 0,05) en ambos grupos de diabéticos con RD y sin ésta al compararlos con el grupo control (fig. 2).

Figura 2
FIG. 2. Niveles de glutatión reducido.

La actividad de la CAT fue significativamente elevada (p < 0,05) en los 2 grupos de diabéticos en relación con el grupo control (fig. 3).

Figura 3
FIG. 3. Actividad de la enzima catalasa.

Los niveles de MDA resultaron elevados significativamente (p < 0,05) en los grupos de diabéticos independientemente que tuvieran o no RD. Los pacientes complicados con RD presentaron mayores valores de MDA con diferencia estadísticamente significativa de p < 0,05, al compararlos con el resto de los grupos (fig. 4).

Figura 4
FIG. 4. Niveles de malonildialdehído.

No encontramos correlación en los niveles de glucemia con respecto a los de GSH y la actividad de la enzima CAT. La severidad de la RD no se correlacionó con los niveles de MDA, GSH ni de la actividad de las enzimas CAT y SOD.

Discusión

La SOD es una enzima que cataliza la dismutación del radical anión superóxido (O2) a peróxido de hidrógeno (H2O2) y oxígeno (O2). Según Marklund y otros,14 esta enzima puede ser inhibida por altas concentraciones de H2O2. Estos autores plantean que la producción elevada de H2O2 conduce a una inhibición de la enzima CuZn-SOD y de la SOD extracelular en seres humanos en asociación con altas concentraciones de catalasa. Estos planteamientos pueden explicar nuestros resultados, los cuales evidencian una inhibición de la enzima SOD.

La célula utiliza para la reducción del H2O2 las enzimas GSH peroxidasa y la catalasa. La catalasa tiene una Km alta para el H2O2, por tanto, su efecto es limitado y sólo puede ejercer su función bajo condiciones donde el NADPH sea un factor limitante o cuando los niveles de H2O2 están particularmente elevados.15 La depleción del GSH y la elevada actividad de la catalasa, asociada a la inhibición de la enzima SOD, sugiere la existencia de altos niveles de H2O2.

Los valores significativamente elevados de MDA en los grupos de diabéticos insulinodependientes sin y con RD en nuestro estudio, demuestran el grado de peroxidación lipídica en los mismos, más acentuado en este último grupo.

Nuestros resultados coinciden con los descritos por Nakamura y otros16 y Augustin y otros17 quienes han encontrado niveles elevados de lipoperóxidos en diabéticos con RD. Otros investigadores señalan que cuando aumenta la concentración de glucosa en un medio de cultivo de células endoteliales humanas de 5 mM a 20 mM se observa un incremento del número de células dañadas por radicales libres, así como la concentración de MDA y de dienos conjugados. La adición de SOD y GSH previenen estos efectos.18 Diversos estudios que evalúan la ocurrencia de daño oxidativo hístico en la membrana epirretinal de los diabéticos con RD, han demostrado que la actividad de la mieloperóxidasa y las sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico se encontraban significativamente elevadas con respecto al grupo control.19,20

Todo lo anterior indica la relación entre las especies reactivas de oxígeno y la RD. La literatura plantea que el estrés oxidativo es un factor significativo en el desarrollo de la disfunción endotelial, elemento básico en la patogenia de las complicaciones vasculares de la diabetes.21

La hipoxia, que es un factor importante en la patogenia de la RD, puede ser inducida por un metabolismo anormal de las prostaglandinas, cuando esto ocurre se inicia un círculo vicioso en el cual la formación de radicales libres de oxígeno y el consecuente daño endotelial desempeñan un papel importante.22

En nuestro estudio, los valores promedio de la glucemia de los pacientes fueron < 10 mmol/L, lo cual denota que el control metabólico en los mismos en el momento del estudio era bueno o regular, lo que puede explicar que no encontráramos correlación entre los valores de glucemia y las EROs estudiadas.

La glucosa sanguínea puede enolizarse y por tanto, reducir el oxígeno molecular bajo condiciones fisiológicas, catalizado por metales de transición, produciendo cetoaldehídos e intermediarios oxidados.23 Las evidencias sugieren que los radicales libres y el H2O2 producidos lentamente por la "autoxidación" de la glucosa, son una causa sustancial de daño estructural de proteínas expuestas in vitro a la glucosa.24-26 En la actualidad se acepta que los productos avanzados de la glicosilación (PAG) desempeñan un papel importante en la patogenia de las complicaciones de la DM. Browlee27,28 plantea que los PGA pueden actuar por 3 mecanismos generales: a) alterando el mecanismo de transducción de señales a través de la membrana celular, b) alterando los niveles de segundos mensajeros, ej. citoquinas, radicales libres, entre otros y c) actuando en la formación intracelular de proteínas y DNA lo que puede alterar la función de las proteínas.

La no correlación entre la severidad de la RD y los parámetros bioquímicos evaluados pudieran explicarse por lo reducido de la muestra y porque la determinación de dichos parámetros fue realizada en un momento determinado; por tanto, expresa un estado puntual y no un período prospectivo.

En conclusión, podemos señalar que las especies reactivas de oxígeno provocan un estrés oxidativo en los diabéticos insulinodependientes, más marcado en los pacientes diabéticos con RD. Aunque el estrés oxidativo no se relacionó con la severidad de la RD, se puede sugerir que éste pudiera constituir un factor más en la patogenia de la RD.

Summary

A cross-sectional study of 20 insulin dependent patient was conducted aimed at studying the relationship between the reactive oxygen species and diabetes mellitus complicated or not with diabetic retinopathy. Patients were distributed into 2 groups. The first group was composed of 11 individuals without diabetic retinopathy, and the second group consisted of 9 subjects with diabetic retinopathy. A control group of 12 sound volunteers was also included. A blood specimen was taken from all patients 12 hours after fasting to determine glucaemia, superoxide dismutase, reduced glutathione, catalase and malonyldialdehyde. In both groups of diabetics the activity of superoxide dismutase and the levels of reduced glutathione were diminished (p < 0,05), whereas the activity of catalase and the levels of malonyldialdehyde were significantly elevated in all cases, compared with the control group. It was suggested that the reactive oxygen species produce an oxidative stress in insulin dependent patients and, particularly, in those with diabetic retinopathy.

Subject headings: REACTIVE OXYGEN SPECIES; DIABETES MELLITUS, INSULINODEPENDENT; DIABETIC RETINOPATHY; OXIDATIVE STRESS.

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Recibido: 15 de septiembre de 1997. Aprobado: 24 de junio de 1998.
Lic. Mercedes Mamposo Solano. Centro de Investigaciones y Evaluaciones Biológicas, Instituto de Farmacia y Alimentos, Calle 222 y ave. 25, La Lisa, Ciudad de La Habana, Cuba.
 
1 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Profesora Asistente. CIEB.
2 Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Auxiliar. CIEB.
3 Especialista de II Grado en Endocrinología. Investigador Titular. Profesor Auxiliar. Instituto Superior de Ciencias Médicas. Facultad de Medicina "Comandante Manuel Fajardo".
4 Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. CIEB.
5 Licenciado en Ciencias Matemáticas. CIEB.

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