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Revista Cubana de Endocrinología, enero-junio, 1995

Trabajos Originales

Instituto Nacional de Endocrinología. Centro de Inmunología Molecular

Evidencias experimentales sobre la naturaleza glicolipídica de los antígenos reconocidos por los anticuerpos antiislotes pancreáticos*

Lic. Eduardo Cabrera,<1> Dr. Luis E. Fernández,<2> Lic. Oscar Díaz,<3> Lic. Adriana Carr,<4> Dra. Gilda Marquina,<5> Lic. Oscar Valiente,<6> Dr. Roberto M. González<7> y Dr. Angel Uriarte<8>

RESUMEN

Se extrajeron glicolípidos de páncreas humano adulto y fetal, con una mezcla de cloroformo, metanol y agua. Se obtuvieron por partición de Folch, y se lograron 4 extractos de páncreas adulto y 1 fetal. Las 5 fases superiores de cada uno presentaron la habilidad de bloquear la reacción del ICA frente a secciones congeladas de páncreas humano, con efecto bloqueador dosis-dependiente. El TLC-ELISA de las fracciones glicolipídicas ácidas de páncreas adulto y fetal con sueros ICA+ aportaron reacciones específicas con 2 glicolípidos: 1 de ellos migraba con el frente del solvente (SG1) y otro (SG2) mostró una movilidad en TLC entre los gangliósidos GM2 y GM1 estándares. Ninguno presentó características de gangliósidos. Los sueros ICA+ reaccionaron en TLC-ELISA con diferentes glicolípidos sulfatados. Se estudió la prevalencia del efecto bloqueador de la fase superior de un sexto extracto glicolipídico de páncreas humano (EGP) en 39 sueros ICA+, de 19 pacientes diabéticos insulinodependientes (DID) y 21 familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 (Fam. 1). Fue hallada una total inhibición en el 82 % y 76 % de los pacientes DID y Fam. 1, respectivamente. Lo anterior sugiere que los antígenos involucrados en el bloqueo de la reacción de los sueros ICA+ presentan características glicolipídicas ácidas, además de aportar nuevas evidencias sobre la naturaleza glicolipídica sulfatada de autoantígenos asociados a DID. Nuestros resultados indican que existe heterogeneidad de los autoanticuerpos antiislotes y que los glicolípidos son los antígenos mayoritarios de los ICA.

Palabras clave: DIABETES MELLITUS INSULINO-DEPENDIENTE/inmunología; ISLOTES DE LANGERHANS/inmunología; ANTICUERPOS ANTIIDIOTIPICOS/inmunología; AUTOANTICUERPOS/inmunología; ANTIGENOS/inmunología; LIPIDOS/inmunología.

INTRODUCCION

Suficientes evidencias indican que la diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID) es una enfermedad autoinmune1 en la cual existe una destrucción específica de las células ß productoras de insulina. Es posible que algunos casos se deban a una destrucción directa, viral o tóxica.2,3 En la mayoría este proceso es pausado y progresivo, y puede prolongarse por algunos años antes de la presentación clínica de la enfermedad.4

Los anticuerpos antiislotes (ICA) están fuertemente asociados con el desarrollo de la DMID, tipo 1 y han sido detectados antes y durante su diagnóstico clínico.5 Hasta ahora, ninguno de los otros anticuerpos descritos han podido desplazar al ICA como el marcador principal de la DMID.6

Los ICA son los autoanticuerpos que han recibido mayor atención en el estudio de los fenómenos inmunológicos en los pacientes con DMID, éstos son inmunoglobulinas, del tipo IgG,7 capaces de reaccionar con todas las células de los islotes de Langerhans.

Se ha propuesto que estos anticuerpos pueden ser el resultado de una respuesta inmune secundaria iniciada por la exposición de los componentes citoplasmáticos comunes para todas las células de los islotes que fueron liberados por daño de las células ß mediante un mecanismo de destrucción primario; se han encontrado con mayor frecuencia (60-85 %) en pacientes diabéticos con diagnóstico clínico reciente de la enfermedad, y va disminuyendo según aumenta la duración de la DMID.8 La reacción de los ICA de- terminados por el método de inmunofluorescencia indirecta quizás incluya varios tipos de anticuerpos dirigidos contra diferentes antígenos, incluyendo algunos con especificidad para las células ß.6 Recientemente Gianani et al.9 demostraron que existe una heterogeneidad de los ICA y aquéllos que muestran un patrón no selectivo a las células ß (reaccionan con todas las células del islote) presentan mayor capacidad para pronosticar la aparición de la enfermedad clínicamente (valor predictivo).

Bonifacio et al., en 1990,10 estudiaron individuos con diferentes concentraciones de ICA en suero durante 9 años, llegaron a la conclusión que los altos títulos de ICA presentan alto valor predictivo en el desarrollo de la DMID, ejemplo: títulos de ICA con > 80 unidades JDF, presentan valor predictivo del 100 % para desarrollar la DMID.

Los resultados de los últimos estudios de seguimiento en familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 sugieren que los títulos bajos de ICA no deben ser utilizados como un marcador eficiente de la DMID, en cambio los títulos de ICA mayores de 40 unidades JDF continúan siendo, hasta el momento, el mejor marcador disponible, particularmente cuando está asociado con otros marcadores inmunológicos,6,10,11 además, los ICA han sido relacionados con la disminución de la insulinosecreción tras la sobrecarga intravenosa de glucosa,12 lo cual constituye un índice de destrucción de las células productoras de insulina.

La estructura de las moléculas a las cuales van dirigidos los ICA permanece siendo un enigma. Nayak et al.13 demostraron que los autoantígenos presentes en las secciones pancreáticas congeladas utilizadas para detectar estos anticuerpos tienen las propiedades de un glicolípido que contiene ácido siálico (gangliósidos). Otros resultados sugieren que este es un glicolípido que migra en cromatografía de capa fina con una movilidad característica de los monocialogangliósidos.14

Recientemente ha sido reportada la reacción directa de los ICA con glicolípidos purificados, mediante el método inmunoenzimático sobre placas delgadas de sílica gel, donde se observó que la mayoría de los sueros ICA+ de pacientes diabéticos reaccionaban con un gangliósido que migraba entre los gangliósidos mayoritarios del páncreas humano GM3 y GD3.15

Actualmente, el ensayo utilizado para detectar los ICA, varía grandemente en sensibilidad y especificidad entre laboratorios,16 debido posiblemente a diferencias metodológicas.

Probablemente, el factor más importante sea la variación de los distintos tejidos pancreáticos utilizados como sustrato.17 El aislamiento y purificación de los antígenos diana de los islotes de Langerhans es un paso crucial con miras a desarrollar ensayos con más reproducibilidad y sensibilidad, lo que proporcionaría una mejor comprensión del proceso autoinmune, en la destrucción de las células ß pancreáticas.

El propósito de nuestro trabajo es determinar si los glicolípidos pancreáticos son los antígenos mayoritarios del ICA, así como establecer nuevas evidencias sobre la naturaleza química de estos antígenos.

MATERIAL Y METODOS

TEJIDOS

Los tejidos de páncreas humano se obtuvieron de 9 sujetos no diabéticos donantes de órganos para trasplante, o de necropsias, con edades de 30 a 70 años. El tiempo máximo de isquemia (desde la muerte hasta la congelación del tejido) fue de 3 horas. Los páncreas fetales humanos fueron colectados de abortos realizados entre las 13 y 20 semanas de embarazo. Fueron recolectados 30 páncreas fetales con un peso de 13,56 g, colocados inmediatamente en nitrógeno líquido y almacenados a -70 oC, hasta la extracción de glicolípidos.

Las secciones de páncreas congeladas, utilizadas como sustrato para determinar los ICA por inmunofluorescencia indirecta17,18 se obtuvieron del páncreas de un fallecido de grupo sanguíneo O, con tiempo de isquemia de 50 minutos.

El tejido tiroideo humano se obtuvo por cirugía del bocio de un paciente con enfermedad de Graves, de grupo sanguíneo O y almacenado a -70 oC. Se utilizaron secciones congeladas de tiroides como sustrato para determinar anticuerpos microsomales tiroi-deos (AMT).

El tejido hepático se obtuvo de ratas Wistar adultas y almacenado a -70 oC. Se emplearon secciones congeladas de hígado como sustrato para determinar anticuerpos antinucleares (AN) por inmunofluorescencia indirecta.18

SUEROS

Se utilizaron sueros ICA+ (> 40 unidades JDF) de 21 familiares de primer grado (hermanos, padres o hijos) de diabéticos tipo 1. Ninguno era diabético en el momento de tomar la muestra de sangre.

Se utilizaron 17 sueros ICA+ (> 20 unidades JDF) de pacientes diabéticos tipo 1.

Se tomaron 15 sueros de pacientes con enfermedad tiroidea de Graves y 10 sueros de diabéticos no insulinodependientes (DMNID), ambos grupos se identificaban como positivos para anticuerpos antimicrosomales tiroideos, antitiroglobulina y antinucleares. En general, estudiamos 10 sueros positivos para cada uno de estos anticuerpos.

REACTIVOS

Las placas (Polygram Sil G) de sílica gel para cromatografía de capa fina (TLC) se adquirieron de la Macherey-Nagel (Duren, FRG); las placas para TLC de alta resolución y el Fractogel TSK DEAE 650 M, de la Merck (Darmstad, FRG); el 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato, de la Sigma (St. Louis, Mo., USA); y el poliisobutilmetacrilato, de la Aldrich (Milwaukee. Wis., USA).

Los patrones de gangliósidos y glicolípidos sulfatados se aislaron a partir de las siguientes fuentes: los gangliósidos de la serie gangliotetraosa, GM2 y GD2 a partir de cerebro humano; el GM3 del bazo de un paciente con la enfermedad de Gaucher; el 3'- LM1 a partir de cauda equina humana; el 3o-isoLM1 y el Fuc 3'-isoLM1 a partir de meconio humano; el SO4--3Galß1-1Cer a partir de cauda equina humana; el SO4-3Galß1-4G1c ß1-1Cer y el SO4-3-G1cUAß1-3Galß1-4G1cNA-cß1-3Galß1-4G1cß1-1Cer a partir de la mielina de nervios periféricos humanos. Todos los estándares fueron caracte-rizados mediante su reacción con anticuerpos monoclonales y por espectometría de masa de bombardeo con átomos rápidos. Se cuantificó cada gangliósido estándar mediante la deter-minación de ácido siálico unido a lípidos.19

Los anticuerpos monoclonales antigangliósidos murinos usados identi-fican GM2, GD3, GD2, 3'-isoLM1 y 3'-LM1 se obtuvieron por inmunización con diferentes líneas celulares de tumores humanos (cortesía del profesor L. Svennerholm). El conjugado de fosfatasa alcalina con anti-IgG humana se adquirió del Jackson Immunoresearch Laboratory (West Grove, Pa., USA) y el conjugado de anti-IgG humana de carnero con fluoresceína de la Wellcome (England). Las insulinas humana y porcina. actrapid, se adquirieron de la Novo-Nordisk (Denmark).

EXTRACCION LIPIDICA

El tejido pancreático se homogenizó en una batidora por 2 minutos a 4 oC con 2 volúmenes de agua destilada, y los lípidos fueron extraídos 2 veces con 20 volúmenes de cloro-formo-metanol-agua (C:M:A) con una proporción final de 4:8:3 por gramo de tejido. Los glicolípidos polares se separaron del resto de los lípidos por partición.20 La fase superior se llevó a sequedad, se resuspendió en agua y se dializó contra una solución amortiguadora de bicarbonato de sodio 0,02 mM pH 7,8 con cambios diarios de dicha solución durante 3 días.

INTERCAMBIO IONICO

La fracción de glicolípidos polares se liofilizó y se disolvió en C:M:A,60: 30:4,5 (en volumen) para ser separada en una columna de fractogel TSK DEAE donde se eluyó con 10 volúmenes (con respecto al volumen total de la columna) de C:M:A,60:30:4,5 y 1 volumen de metanol (fracción neutra), 10 volúmenes de acetato de potasio (KAc) 0,01 M en metanol (donde eluyen los monosialogangliósidos y algunos glicolípidos ácidos) y finalmente 10 volúmenes de KAc 0,1 M en metanol (donde eluyen los polisialogangliósidos y otros glicolípidos ácidos). Las fracciones 0,01 y 0,1 M de KAc se llevaron a sequedad en un rotaevaporador, fueron disueltas en agua y dializadas con el mismo procedimiento anterior.20 Estas fracciones se secaron y se guardaron disueltas en C:M:A,60:30:4,5 a -20 oC.

Se procesaron 8 páncreas adultos y un pool de páncreas fetales por el método anteriormente descrito, hasta obtener las fases superiores y se dividieron de la siguiente forma: fase superior 2 (FS2), FS3, FS4 (realizadas a partir de 2 páncreas de adultos); FS5 y FS6 (realizadas a partir de solo un páncreas de adulto): FSf (realizada a partir de un pool de 30 páncreas fetales). Las FS4, FS5, FS6 y FSf fueron cromatografiadas y se obtuvieron sus respectivas fracciones glicolipídicas ácidas.

TRATAMIENTO CON ALCALI DEL EXTRACTO LIPIDICO (FS2)

El extracto lipídico (FS2) se disolvió en NaOH 0,5 M y se incubó toda la noche a temperatura ambiente de acuerdo con el método de Riboni et al. (FS2s).21

BLOQUEO DEL ICA

Se evaluó la unión de los ICA a los extractos glicolipídicos pancreáticos y fracciones por medio de la capacidad de bloquear la reacción de los ICA a las secciones pancreáticas congeladas. La cual se realizó mediante la técnica descrita por Colman et al.14 con las siguientes modificaciones: se añadieron a los tubos que contenían los extractos lipídicos (fracciones 0,01 M, 0,1 M de KAc y fracción de glicolípidos polares) 200 mL de los sueros ICA+ diluidos (2 diluciones por debajo del título de ICA) en tampón fosfato salino pH 7,4 (por duplicado). El ICA se detectó por la técnica cualitativa de inmunofluorescencia indirecta usando una dilución 1:50 del conjugado de fluoresceína y anti-IgG humana de carnero.17,18 El control consistió en la dilución del suero en ausencia de las fracciones. El título de los ICA se transformó en unidades JDF (Unidad JDF-juvenil diabetes foundation, unidad arbitraria basada en la asignación del valor 80 a un suero internacional ICA+.)

DETECCION DE ANTICUERPOS ANTIISLOTES FIJADORES DE COMPLEMENTO (CF-ICA)

Los CF-ICA fueron determinados por inmunofluorescencia indirecta,22 sobre el mismo sustrato (secciones pancreáticas) utilizado en las técnicas de bloqueo e ICA.

ESPECIFICIDAD DEL EFECTO BLOQUEADOR DE LA FRACCION DE GLICOLIPIDOS POLARES SOBRE LOS ICA

Los experimentos de inhibición de los autoanticuerpos antinucleares (AN), antimicrosomales tiroideos (AMT) y antitiroglobulina (AT) con los extractos glicolipídicos pancreáticos FS6 fueron realizados con las mismas condiciones de la técnica de bloqueo de los ICA. En el caso de los AT, la determinación fue realizada por una técnica de hemoaglutinación pasiva23 con un kit elaborado en nuestro laboratorio.

DETECCION DE ANTICUERPOS ANTIINSULINA (AI Y AAI)

Los anticuerpos antiinsulina fueron detectados por el método radioisotópico competitivo descrito por Vardi et al.24 En el cual se mide la cantidad de insulina-I125 que es capaz de unir un volumen determinado de suero. Fueron considerados individuos positivos aquéllos que presentaron valores superiores a 40 nU/mL (X ± 3 DE de 100 sujetos controles).

INHIBICION DE LOS ANTICUERPOS ANTIINSULINA EN SUEROS ICA+

Los sueros AI+ se incubaron toda la noche a 4 oC con insulina humana y porcina altamente purificadas (Ac-trapid HM 100 UI/mL y Actrapid MC 80 UI/mL, NOVO NORDISK A/S) a una concentración de 1 mg/mL de suero.25 Se incubaron 14 sueros con títulos mayores de 150 nU/mL de AI a una dilución 1:2 en PBS (1 mG/mL de suero) y sus controles (incubados sin insulina). Las muestras se centrifugaron a 10 000 x g durante 5 minutos. Los sobrenadantes de los sueros adsorbidos y de los no adsorbidos se aplicaron a las secciones pancreáticas por 30 minutos a temperatura ambiente. Las secciones fueron lavadas con PBS por 30 minutos y seguidamente se aplicó un conjugado de fluoresceína-anti IgG humana de carnero por 20 minutos. Los tejidos fueron lavados en PES durante 90 minutos y observados en un microscopio de fluorescencia.18,25

INMUNOTINCION EN CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA (TLC-ELISA)

Los glicolípidos ácidos aislados en la fracción 0.01 M y los estándares de gangliósidos puros se aplicaron en líneas de 5 mm de ancho en placas de TLC y se corrieron con una mezcla de C:M:Amoníaco 2,5 M + KC1 0,25 %, 50:40:10 (por volúmenes). Después de la evaporación del solvente, las placas se fijaron con una dilución al 0,5 % de poliisobutilmetacrilato en hexano, las uniones inespecíficas se bloquearon con leche en polvo descremada. La placa se incubó toda la noche a 4 oC con los sueros ICA y el control (ICA-) y, posteriormente, se incubó con el conjugado de fosfatasa alcalina y anti-IgG humana de chivo a temperatura ambiente por 5 horas. El color se observó con el sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de 30-60 minutos a 37 oC.26

RESULTADOS

BLOQUEO DEL ICA

La incubación de los sueros ICA+ con las fases superiores de los extractos lipídicos de páncreas humano adulto (FS3, FS4 y FS5) y de los extractos de páncreas fetal (FSf) disminuye marcadamente la reacción de los ICA a las secciones de páncreas congeladas. El efecto bloqueador es dosis dependiente y comienza a partir de una concentración de 4 mg en cada una de las fases superiores de los extractos lipídicos (figura 1).

FRECUENCIA DEL EFECTO BLOQUEADOR DE LA FS6 EN SUEROS ICA+

Se encontró total inhibición de los sueros ICA+ con la FS6 en el 82,35 % (14/17) y el 76,19 % (16/21) de los diabéticos insulinodependientes y familiares de primer grado de diabéticos tipo 1, respectivamente. Se observaron inhibiciones parciales y no inhibiciones de los sueros ICA+ con la FS6 en el 5,88 % (1/17), 11,76 % (2/17) de los diabéticos tipo 1 y 19,04 % (4/21), 4,76 % (1/21) de los familiares de primer grado de diabéticos tipo 1, respectivamente. En resumen, la inhibición total y parcial de los sueros ICA+ con la FS6 se observó en 15 de 17 (88,23 %) y en 20 de 21 (95,23 %) de los diabéticos tipo 1 y familiares de primer grado, de diabéticos tipo 1, respectivamente (figura 2, tablas 1 y 2).

TABLA 1. Características de los sueros ICA+ en diabéticos insulinodependientes

Relación con el efecto bloqueador del ICA

No.  Edad        Duración       ICA         Bloqueo                  

  AAI/AI

(años)      de la DM       JDFus       del ICA+       CF-ICA      

(nU/mL)

1    10         Inicio          320           -             P            190

2    21         Inicio          320           -             N             10

3    14         Inicio          320           -             N              0

4    22         Inicio          320           +             P            160

5    10         Inicio           80           -             P            600

6     5         Inicio          160           -             P            340

7     6         Inicio           80           -             P            360

8     8         Inicio          320           -             P            120

9    30         Inicio           40           -             N              0

10    40         Inicio          320           -             P            

80o

11     7          2 m            160           -             P           

250

12     8          6 m             80          D+             N            

20

13    32         10 a             20           +             N           

650

14    10          2 m             80           -             P          1

120

15    15          5 m             40           -             N           

840

16     8          7 m            160           -             N           

640

17    43         15 a             40           -             N            

30
Leyendas: ICA: Anticuerpos antiislotes. AAI: Autoanticuerpos antiinsulina. AI: Anticuerpos antiinsulina. +: No inhibición del ICA+. ¾:: Inhibición del ICA+. CF-ICA: ICA fijadores de complemento. P: Positivo. N: Negativo. D+: Inhibición débil del ICA+. o: Durante 5 años fue tratado como diabético tipo 2.

Nota: Anticuerpos antiinsulina > 40 nU/mL. Los sueros del 1 al 10 fueron también inhibidos por F 0,01 M.

TABLA 2. Características de los sueros ICA+ en familiares de primer grado de diabéticos tipo 1

Relación con el efecto bloqueador sobre sueros ICA+

Edad      ICA        Bloqueo                    AAI/AI      Relación

con

No.    (As)      JDF       del ICA       CF-ICA       (nU/mL)      pacientes

DMID

1       7       160          -            N             0           hermano

2      16        80          -            N           120           hijo

3      33        80         D+            N             0           padre

4      12       160          -            P            10           hijo

5      31        40          -            N             0           padre

6      34       160          -            P             0           padre

7       3       160          -            N             0           hijo

8      35       160         D+            N            20           padre

9      10        80          -            P            70           hermano*

10      12       160          -            P             0           hijo

11      44        80         D+            N             0           hijoo

12      15        40          -            N            30           hermano

13      14        80          -            P             0           hermano

14       6        40          -            P           340           hermano

15      15        40         D+            P            10           hermano

16      35        40          +            N           690           padre

17       3       160          -            P           250          

hermano*

18      13       160          -            P            30           hijo

19      32        40          -            N             0           padre

20      36       160          -            P           570           padre

21       7        80          -            P             0           hermano
Leyendas: ICA: Anticuerpos antiislotes. AAI: Autoanticuerpos antiinsulina. P: Positivo: N: Negativo. +: No inhibición del ICA. o: Familiar de 1er grado con enfermedad de Graves y padre con otras enfermedades autoinmunes (Graves y vitiligo). *: Desarrolló DMID después de 6 a 8 meses de la detección de ICA.

* Premio anual de Salud Pública, 1992.

BLOQUEO DE LA FS2 SOBRE EL ICA

El efecto bloqueador de los ICA con el extracto lipídico saponificado se comportó de la misma forma que las fases superiores sin saponificar (figura 3).

EFECTO BLOQUEADOR DE LAS FRACCIONES GLICOLIPIDICAS ACIDAS DE PANCREAS HUMANOS SOBRE EL ICA

La fracción glicolipídica ácida eluida de una columna cromatográfica de intercambio iónico con una solución 0,01 M de KAc (monosialogangliósidos y glicolípidos ácidos) a partir de FS4 presentó un efecto bloqueador sobre los ICA (figura 3).

No se observó inhibición con la fracción glicolipídica ácida eluida con una solución 0,1 M de KAc (polisialogangliósidos y otros glicolípidos ácidos) aún cuando se emplearon cantidades superiores a 4 mg (figura 3).

DETECCION DE LOS CF-ICA

Los CF-ICA estaban presentes en el 60 % (18/30) en los sueros ICA+ inhibidos con FS6, 17 de estos CF-ICA+ contenían altos títulos de ICA (> 80 unidades JDF) y el 25 % (2/8) de los sueros ICA+ no inhibidos con FS6 fueron también CF-ICA+, uno de estos 2 sueros CF-ICA+ presentaba alto título de ICA (50 %) (figura 4, tablas 1 y 2). La presencia de CF-ICA fue más frecuente en los sueros con títulos altos de ICA (64,28 %, 18 de 28) y en 2 de 10 (20 %) de los sueros con bajo título de ICA (p < 0,05) (figura 5, tablas 1 y 2).

Todos los sueros CF-ICA + de diabéticos insulinodependientes presentaron altos títulos de ICA, en los que también el 90 % (8/9) de éstos fueron inhibidos con FS6 (tablas 1 y 2).

En general no existe correlación entre los sueros ICA+ inhibidos y no inhibidos con FS6 y los altos títulos de ICA [23 de 30, (76,66 %)] de los sueros ICA+ inhibidos y 5 de 8 (62,50 %) de los sueros ICA+ no inhibidos con FS6 contenían altos títulos de ICA, respectivamente (tablas 1 y 2).

ESPECIFICAD DEL EFECTO BLOQUEADOR DE LA FS6 SOBRE LOS ICA

La especificidad del bloqueo del ICA se demostró cuando ninguno de los diferentes sueros positivos para los anticuerpos AMT, AT y AN fueron inhibidos con FS6.

DETECCION DE AUTOANTICUERPOS ANTIINSULINA (AAI)

Los AAI se observaron en el 70 % (7/10) de los diabéticos tipo 1 recién diagnosticados antes del inicio de la terapia insulínica y en el 28,57 % (6/21) de los familiares de primer grado de diabéticos tipo 1. Los AAI se encontraron en el 61,11 % (11/18) de los sueros CF-ICA+ y en el 15,38 % (2/13) de los sueros CF-ICA negativos de los pacientes diabéticos tipo 1 con diagnóstico reciente y familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 (p < 0,05). Entre los sueros de los pacientes CF-ICA+ con diabetes tipo 1 recién diagnosticados, el 100 % (7/7) presentó AAI (figura 6, tablas 1 y 2). La presencia de AAI no estaba relacionada con el efecto inhibidor de la fracción FS6 sobre los ICA.

INHIBICION DE LOS ANTICUERPOS ANTIINSULINA EN SUEROS ICA+

El estudio de inhibición con insulina humana y porcina se realizó en 6 familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 y 12 pacientes diabéticos tipo 1 positivos para AAI y AI. Sólo 1 de estos sueros ICA+ con alto título de AAI (familiar de primer grado de diabético tipo 1) fue inhibido con insulina humana. La reacción de inhibición del AAI fue dosis dependiente sólo con insulina humana. Lo cual indica que este suero debe ser considerado como un ICA falsopositivo.

TLC-ELISA

Los resultados de la incubación de 3 sueros ICA+ a una dilución 1:400 sobre las fracciones de glicolípidos ácidos (0,01 M KAc) obtenidas a partir de la FS5 (A) y FSf (B), y los gangliósidos 3'-LM1(C), 3'-isoLM1 (D), y fucosil 3'-isoLM1 (E) así como también una mezcla de gangliósidos estándares de cerebro humano (F) se muestran en la figura 7.

Una reacción específica fue observada en los sueros ICA+ contra 2 gliocolípidos presentes en las fracciones acídicas de los páncreas adulto (A) y fetal (B). Uno de los glicolípidos migra con el frente del solvente (GS1) y el otro presenta una movilidad sobre TLC entre los gangliósidos GM2 y GM1 estándares (GM2-1) y una movilidad similar a los gangliósidos 3o-LM1 y 3o-isoLM1 (figuras 8 y 9). El suero ICA- no reaccionó con las fracciones glicolipídicas y gangliósidos estándares.

Los 3 sueros reaccionaron de forma similar contra los 2 glicolípidos de las fracciones ácidas de páncreas adulto y fetal en el TLC-ELISA.

REACCIÓN DE LOS ICA CONTRA GLICOLIPIDOS SULFATADOS EN TLC-ELISA

En la figura 10 se observa la reacción directa de los sueros ICA+ contra 3 diferentes glicolípidos sulfatados [SO4-3Galß1-1Cer (L), SO4-3Galß1-4Glcß1-1Cer (K) y el SO4-3-G1c-UAß1-3Galß1-4G1cNAcß1-3Galß1-4G1cß1-1Cer (I)] y contra 2 glicolípidos de páncreas adultos. Los 3 sueros ICA reaccionaron de forma similar contra los 3 glicolípidos sulfatados.

DISCUSION

Colman et al.14 demostraron la habilidad de extractos lipídicos, obtenidos a partir de 2 páncreas humanos, de bloquear la reacción del ICA sobre secciones de páncreas congelados. En nuestro estudio encontramos el mismo efecto, el cual fue dosis-dependiente y comenzaba a partir de 4 mg de los diferentes extractos de páncreas adultos y el pool de páncreas fetales.

En la actualidad, las técnicas por inmunofluorescencia indirecta son utilizadas para determinar los ICA en pacientes diabéticos tipo 1 recién diagnosticados y en sujetos con alto riesgo. Los anticuerpos contra insulina, proinsulina, GAD (64k), fragmentos trípticos del antígeno 64K (37K/40K), carboxipeptidasa H, y otros antígenos están distribuidos en todos los islotes pancreáticos.6,7 Existe la posibilidad de que los ICA incluyan anticuerpos contra las diferentes especificidades antigénicas anteriormente mencionadas, detectadas mediante la técnica convencional de inmunofluorescencia indirecta.18 Esta heterogeneidad ha sido sugerida previamente en sujetos prediabéticos y en pacientes con poliendocrinopatías autoinmunes.9,18

La técnica de inhibición del ICA con extractos glicolipídicos pancreáticos (EGP) fue utilizada para discriminar varias subpoblaciones de ICA. En nuestro estudio encontramos 3 subtipos de ICA que dependen de su efecto bloqueador con los EGP: sueros con total, parcial y ninguna inhibición de reacción de los ICA a las secciones pancreáticas. Nuestro estudio demostró que la mayoría de los sueros ICA+ de los siguientes diabéticos tipo 1 y familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 presentaron una total inhibición de la reacción de los ICA a las secciones pancreáticas por los EGP.

Algunos sueros ICA+ se inhibieron parcialmente, y esto sugiere que quizás contengan anticuerpos antiglicolípidos con baja avidez o al menos 2 diferentes anticuerpos contra distintas especificidades antigénicas. La no inhibición de la reacción de los ICA a las fracciones pancreáticas en el 7,89 % de los diabéticos tipo 1 y familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 nos indica que los ICA contra antígenos glicolipídicos y no glicolipídicos coexisten.

Los resultados obtenidos por Mc Laren et al.27 corroboran los nuestros al encontrar que el 40 % (2 de 5) de los sueros ICA+ disminuyeron su reactividad contra las secciones de páncreas congelados al ser preadsorbidos con GAD (64K) en pacientes diabéticos tipo 1 y el 11 % (1 de 9) en individuos prediabéticos (individuos ICA+ los cuales seguidamente desarrollaron DMID), pero la eliminación completa de dicha reactividad por GAD no fue posible en todos los individuos. Llegaron entonces a una conclusión similar a la nuestra, los ICA contra el antígeno GAD y no GAD coexisten.

La comparación de las frecuencias de inhibición de los ICA con los antígenos glicolipídicos pancreáticos y GAD, nos hace pensar que la mayoría de los ICA están dirigidos contra los glicolípidos pancreáticos.

En estudios de familiares donde se ha observado persistencia de altos títulos de ICA y presencia de CF-ICA se han correlacionado con el deterioro de las células ß y progresión hacia diabetes tipo 1 en individuos no diabéticos.28

Dean et al.29 sugieren que los CF--ICA no son más que un ICA convencional y que son predominantemente, una IgG de la subclase IgG3. Sin embargo, existe en la actualidad el consenso de que los CF-ICA son simplemente ICA de altos títulos.30 Nosotros también demostramos que los CF-ICA estaban asociados con los altos títulos de ICA detectables por la técnica estándar de inmunofluorescencia.

Nuestro estudio demuestra que la mayoría de los sueros ICA+ inhibidos por EGP contienen CF-ICA con altos títulos de ICA, pero desafortunadamente estos resultados no fueron significativos cuando fueron comparados con los sueros ICA+ no inhibidos por EGP, posiblemente por el bajo número de muestras.

Recientemente Seibler et al.31 demostraron en individuos no diabéticos ICA+ que anticuerpos al antígeno 64K, CF-ICA y AAI están fuertemente correlacionados con el deterioro de la función de las células ß.

Nosotros demostramos en este estudio una asociación entre el CF-ICA y AAI los cuales son considerados como marcadores serológicos confiables para la destrucción activa de las células ß y la progresión a diabetes en familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 cuando éstos están en combinación.28

Utilizando una técnica radioisotópica competitiva, Ziegler et al.32 encontraron que el 53 % de los diabéticos tipo 1 recién diagnosticados presentaban AAI. La frecuencia y concentración de estos anticuerpos están correlacionadas inversamente con la edad, ellos también encontraron el 53 % de familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 ICA+, positivos para AAI. Nosotros encontramos que el 70 % de los diabéticos recién diagnosticados ICA+ fueron positivos para AAI. Por el contrario sólo el 28 % de los familiares de primer grado ICA+ presentaron AAI. Scott-Morgan et al.25 describieron un suero de un paciente que padecía de síndrome hipoglicémico autoinmune a la insulina el cual reacciona con los residuos de insulina presentes en el páncreas fresco humano y daba una reacción falso positiva de ICA en la técnica de inmunofluorescencia indirecta. En nuestro estudio sólo una muestra de los sueros ICA sobre secciones de páncreas humano con alto título de AAI fue inhibido específicamente con insulina humana. El suero fue además específico a la insulina humana porque el mismo no reaccionó con las secciones de páncreas de ratón. Nuestros resultados sugieren que los AAI pueden ser interpretados incorrectamente como ICA sobre secciones de páncreas congelados. En este sentido, esto confirma que los sueros AAI pueden ser completamente específicos a la insulina humana, la porcina es incapaz de eliminar los AAI y por lo tanto sería una fuente de interpretaciones erróneas.

Los sueros que contienen anticuerpos que sólo reaccionan con células ß (patrón selectivo) y reaccionan con los páncreas humanos y de rata, pero no con los de ratón, son considerados como diferentes de los sueros que contienen anticuerpos que reaccionan con todas las células de los islotes. Los ICA selectivos a las células ß han sido reportados en pacientes con poliendocrinopatías autoinmune y en familiares de primer grado de diabéticos tipo 1 que no han desarrollado diabetes.9,18

Mediante el uso del ensayo de bloqueo del ICA con fracciones glicolipídicas purificadas a partir de páncreas humanos por TLC preparativa, Colman et al.14 demostraron que el efecto bloqueador estaba asociado con 2 fracciones: una que migraba con el frente del solvente y la segunda que migraba entre los gangliósidos estándares de cerebro bovino GM2 y GM1. Las fracciones de glicolípidos ácidos eluidas de una columna de fractogel TSK DEAE con una solución de KAc 0,01 M mostraron un efecto inhibitorio sobre el ICA, indicando la naturaleza acídica de las moléculas responsables de este efecto. La acción bloqueadora de la fase superior tratada con álcali sobre los sueros ICA+ demuestra la naturaleza álcali-estable de las moléculas que causan dicho efecto. El TLC-ELISA nos provee de nuevas evidencias acerca de la posible naturaleza química de las moléculas GS1 y GS2. La coincidencia en movilidad y teñido con el ICA en TLC de GS1 y el glicolípido (SO4-3Ga1ß1-1Cer) sugieren que ambos sean la misma molécula. La obvia naturaleza acídica de GS1 indica que su estructura química está relacionada a un cerebrósido sulfatado.14 Recientemente hemos estudiado la composición completa de los gangliósidos del páncreas humano adulto (13 componentes) y fetal (14 componentes) (resultados no publicados). Encontramos que la banda teñida con el reactivo resorcinol y que migraba entre los estándares GM2 y GM1 de cerebro humano estaba compuesta por la mezcla de los gangliósidos 3'-isoLM1 (2 %) y 3'-LM1 (98 %). El gangliósidos Fuc 3'-isoLM1 también fue encontrado en la fracción de gangliósidos monosialos de páncreas adulto y fetal. Estudiamos estos 3 gangliósidos por la técnica de TLC-ELISA por ser GM2-1 identificado como 3'-LM1 y 3'-isoLM114,15 y Fuc-3'isoLM1, por su carácter fucosilado.33

La reacción negativa de los sueros ICA+ en el TLC-ELISA con los gangliósidos estándares 3'-LM1, 3'-isoLM1 y Fuc-3'isoLM1 junto con las movilidades similares entre GS2 y los gangliósidos no fucosilados de la serie lacto nos hace dudar de la naturaleza gangliosídica de los autoantígenos que reaccionan con los ICA. Sin embargo, el antígeno del ICA es sensible a la digestión con neuroaminidasa sobre secciones pancreáticas, por lo tanto, además de los monosialogangliósidos, otros glicolípidos ácidos como los sulfátidos pudieran ser los antígenos blancos del ICA. Los resultados en TLC-ELISA sugieren que el glicolípido GS2 no es ninguno de los gangliósidos ya mencionado. La reacción de los sueros ICA+ con los diferentes glicolípidos sulfatados sugiere que GS2 pudiera ser un glicolípido sulfatado, y ello está correlacionado con la evidencia del carácter glicolipídico ácido y álcali-estable de esta molécula. GS1 y GS2 quizás sean 2 moléculas diferentes que comparten el mismo epítope en el cual los grupos sulfatos están involucrados. Durante la pasada década fueron acumuladas considerables evidencias que indicaban que los anticuerpos antiglicolípidos podían ser detectados en el suero de diferentes enfermedades inmunológicas;34 esto nos ayudaría a explicar la posible asociación de la diabetes tipo 1 con otras enfermedades autoinmunes.

Nuestros datos indican que existen, al menos 4 antígenos blancos con múltiples epítopes sobre las secciones pancreáticas: la mayoría pudiera ser reconocida por un glicolípido sulfatado (GS2) y un posible cerebrósido sulfatado (GS1) el cual comparta el mismo epítope, con una reactividad no selectiva hacia las secciones pancreáticas; el tercer antígeno (minoritario) pudiera ser la GAD (64K)27 y finalmente, la insulina porque los AAI pudieran ser interpretados erróneamente como ICA sobre secciones de páncreas humanos con un patrón selectivo de ICA. En resumen, los ICA contra los antígenos glicolipídicos y no glicolipídicos en páncreas humanos coexisten.

Nuestro estudio sugiere que existe una heterogeneidad de los ICA y que los glicolípidos, especialmente los sulfatados, pudieran ser los antígenos mayoritarios del ICA.

Aislar y caracterizar estos glicolípidos pudiera permitirnos desarrollar técnicas cuantitativas más precisas y reproducibles para detectar los ICA.

CONCLUSIONES

 

<1>Licenciado en Biología. Investigador Agregado. Jefe del Departamento de Inmunología. Instituto Nacional de Endocrinología.
<2>Doctor en Ciencias Químicas. Investigador Agregado. Jefe del Grupo de Inmunoquímica. Centro de Inmunología Molecular.
<3>Licenciado en Bioquímica. Departamento de Inmunología. Instituto Nacional de Endocrinología.
<4>Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigadora. Grupo de Inmunoquímica. Centro de Inmunología Molecular.
<5>Doctora en Ciencias Químicas. Investigadora Auxiliar. Grupo de Inmunoquímica. Centro de Inmunología Molecular.
<6>Licenciado en Química. Investigador Auxiliar. Grupo de Inmunoquímica. Centro de Inmunología Molecular.
<7>Doctor en Ciencias Médicas. Investigador Titular. Jefe del Laboratorio de Diabetes. Instituto Nacional de Endocrinología.
<8>Doctor en Ciencias Bioquímicas. Investigador Titular. Departamento de Inmunología. Instituto Nacional de Endocrinología.

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