Indice Anterior Siguiente
Rev Cubana Endocrinol 1996;(7)1

Trabajos Originales

Instituto Nacional de Endocrinología

Dos radioinmunoanalisis (extractivo y directo) para cuantificar progesterona plasmática

Lic. Amparo Teresa Nisembaum Alas, Dra. Ada Julia Machado Curbelo, Lic. Ana Maribel Santander López,1 Dra. Nieves Andino Valdés2 y Lic. Mayda Martínez Delgado

RESUMEN

Se desarrollaron dos radioinmunoensayos (extractivo y directo) para cuantificar los niveles de progesterona plasmática con trazador radiactivo yodado. Se preparó el trazador según el método de Nars y Hunter, modificado. Se probó la inmunorreactividad del trazador frente a un antisuero antiP-3CMO:BSA (HRP/WHO) y en la titulación del mismo se obtuvo como dilución de trabajo 1:900 000 para el ensayo extractivo y 1:675 000 para el RIA directo. Se validaron ambos ensayos en cuanto a precisión (CV intra e interensayo) (RIA extractivo: 7,14-8,18 %, y 12, 54-18, 35 % intra e interensayo; RIA directo: 5,51-6, 18 % y 11, 07-13, 72 % intra e interensayo), sensibilidad (1,32 pg/tubo RIA extractivo y 28,17 gp/tubo RIA directo) y recuperación (91-94 % RIA extractivo y 98, 2-98, 7 % RIA directo). Se obtuvieron resultados acordes con los reportados en la literatura. Se compararon los resultados brindados por estos RIAs y un ensayo de referencia (HRP/WHO), se procesaron 135 muestras (60 fase folicular y 75 fase lútea del ciclo menstrual). No se encontraron diferencias significativas (p < 0,05) al emplear el test t de Students para series pareadas y los coeficientes de correlación fueron altamente significativos al comparar los resultados hallados con el RIA extractivo y el ensayo de referencia y los obtenidos utilizando ambos RIAs, extractivo y directo, en proceso de validación. Se concluye que ambos pudieran ser utilizados en la Clínica de Infertilidad para cuantificar niveles plasmáticos de progesterona.

Palabras clave: PROGESTERONA/sangre; TRAZADORES RADIOACTIVOS; INMUNOENSAYO/métodos.

INTRODUCCION

La progesterona, esteroide de la serie C21, es el más potente progestágeno natural, cuya función es la preparación del útero para el embarazo y el mantenimiento de éste, por lo cual, el cuerpo lúteo produce apreciables cantidades de esta hormona.1

En la clínica, se cuantifica la progesterona para confirmar la ovulación, determinar defectos en la fase lútea del ciclo menstrual y verificar la efectividad de los procedimientos de inducción de la ovulación.2,3 La cuantificación de progesterona en la fase lútea del ciclo menstrual se ha considerado como medición exacta de la función del cuerpo lúteo.4

Entre las 24 y las 48 horas antes de que se produzca el pico preovulatorio de la hormona luteinizante (LH), se incrementan los niveles plasmáticos de progesterona.5 Desde hace algunos años se ha comenzado a utilizar en la Clínica de Fertilización In Vitro y Trasplante Embrionario (FIV/TE) este incremento de los niveles de progesterona al final de la fase folicular del ciclo menstrual como un índice predictor del pico preovulatorio de LH.6

De lo anterior se infiere la necesidad de contar con métodos para su cuantificación, sencillos, rápidos y económicamente rentables como los radioinmunoensayos (RIAs) que emplean trazadores yodados (I125) pues proporcionan ventajas a los ensayos en cuanto a sensibilidad y rapidez sobre los RIAs que utilizan trazadores radiactivos tritiados (3H).7-9

A lo anterior, se suma el hecho de que es posible el montaje de radioinmunoensayos que no requieran de extracción del esteroide con solventes orgánicos,6,10 lo que reporta otras ventajas económicas y prácticas.

El objetivo del presente trabajo fue desarrollar 2 radioinmunoanálisis (RIAs) (extractivo y directo) para cuantificar progesterona plasmática utilizando trazador radiactivo yodado.

MATERIAL Y METODO

TITULACION DEL ANTISUERO

Utilizamos un antisuero monoclonal antiprogesterona-3-carboximetiloxima conjugada con albúmina bovina (P-3CMO:BSA), del juego de reactivos para cuantificar progesterona plasmática, del Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO).11

Titulamos este antisuero y para ello, enfrentamos diferentes diluciones del mismo (1:45 000, 1:90 000, 1:225 000, 1:450 000, 1:900 000, 1:1 350 000, 1:1 800 000, 1:2 250 000, 1:2 700 000) a un conjugado de progesterona-11-hemisuccinato-histamina-I 125 (solo y en presencia de 400 ng de danazol/tubo) y determinamos la unión máxima (%Bo), escogimos como dilución de trabajo la que estuviese entre 30 y 35 %.

PREPARACION DEL TRAZADOR RADIACTIVO

Realizamos el marcaje según el método descrito por Nars y Hunter,8 modificado, para lo cual empleamos progesterona-11-hemisuccinato (P-11HS) (Sigma), como derivado del esteroide.

Purificamos el conjugado por cromatografía líquida de alta presión (HPLC) (en fase reversa), lo cual constituyó una modificación del método original, en el cual se empleaba una cromatografía en capa delgada con soporte de silicagel y sistema de solventes benceno:metanol:ácido acético (75:24:1).

Las condiciones utilizadas para la cromatografía en fase reversa fueron: Columna Ultropac Scherisorb RP18 analítica, con dimensiones de 4 x 250 mm, equilibrada con mezcla de metanol-agua (60-40 %), flujo de 1 mL/minuto y presión de 200 bar.

Aplicamos 0,1 mL del residuo orgánico disuelto en metanol y efectuamos la elución en condiciones similares, colectamos 3,0 mL por tubo.

A todas las fracciones les determinamos:

A partir del volumen de conjugado activo, calculamos la dilucion de trabajo, de forma tal que se obtuvieran aproximadamente 15 000 cpm/0,1 mL.

RADIOINMUNOANALISIS CON EXTRACCION DEL ESTEROIDE

Por este método cuantificamos los niveles de progesterona plasmática empleando un paso extractivo previo para separar la hormona de las proteínas que la transportan (transcortina y albúmina).12

La cuantificación se efectúo según el esquema que se muestra en la figura 1.

RADIOINMUNOANALISIS DIRECTO

Cuantificamos la progesterona total de acuerdo con el método descrito por Ratcliffe10 modificado, en el cual se utilizan 400 ng de danazol por tubo para desplazar a la hormona de su unión con las proteínas transportadoras.12

El protocolo seguido en este RIA para cuantificar progesterona se muestra en la figura 2.

CURVA DOSIS-RESPUESTA

El estándar utilizado fue el perteneciente al juego de reactivos del Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO).11

A partir de una solución etanólica de 250 nMol/L de progesterona, tomamos 0,1 mL a los que les adicionamos 10,0 mL de tampón fosfato 0,01 M, gelatina 0,1 %, pH = 7,4 y con ésta, preparamos por diluciones sucesivas, las curvas dosis-respuestas.

Para el ensayo con extracción, el rango de las concentraciones de la curva dosis-respuesta estuvo entre 0,08 y 2,50 nMol/L, mientras que para el ensayo directo, el rango osciló entre 0,16 y 5,00 nMol/L.

VALIDACION DE LOS ENSAYOS

Calculamos la sensibilidad de cada ensayo a partir de los criterios propuestos por Ekins13 por tanto los expresamos como 2 desviaciones estándares de la radiactividad unida al antisuero en ausencia de sustancia no radiactiva.

Para ambos RIAs efectuamos ensayos de paralelismo para lo cual realizamos simultáneamente 2 curvas, una dosis-respuesta y otra con diluciones sucesivas de una muestra problema y comprobamos si existían diferencias significativas entre las varianzas y sus pendientes, mediante un análisis para rectas de regresión de primera clase.14

A partir de diluciones de un pools de concentraciones conocidas, de forma tal que se abarcaran los valores bajo, medio y alto de las curvas dosis-respuestas, realizamos ensayos de repetibilidad (12 veces en un mismo ensayo) y reproducibilidad (en 5 ensayos diferentes) y determinamos los coeficientes de variación en cada caso, como parte del estudio de la precisión de los RIAs.15

Para el ensayo de recuperación, utilizamos una muestra con una concentración de progesterona conocida, le añadimos una cantidad exacta de una solución estándar de progesterona pura (HRP/WHO) y determinamos la concentración de progesterona recuperada por ambos RIAs (extractivo y directo).

Para el ensayo extractivo, la solución estándar empleada tuvo una concentración de 0,625 nMol/L y para el RIA directo la concentración fue de 1,25 nMol/L.

Realizamos este experimento en 4 ocasiones diferentes y en similares condiciones.

Tomamos, como RIA de referencia, el juego de reactivos para la cuantificación de progesterona de HRP/WHO,11 ensayo extractivo y que utiliza trazador radiactivo tritiado.

Lo procesamos empleando el ensayo de referencia y los RIAs con trazadores radiactivos yodados en proceso de validación, 135 muestras, 60 correspondientes a la fase folicular (3-5 días del ciclo menstrual) y 75 muestras de fase lútea (21-23 días del ciclo menstrual) de pacientes con obstrucción tubárica bilateral del Programa de Fertilización In Vitro y Transplante Embrionario (FIV/TE) del Instituto Nacional de Endocrinología, de Ciudad de La Habana, Cuba.

Los resultados obtenidos con los ensayos extractivos (RIAs tritiado y yodado) fueron correlacionados entre sí y comparados mediante una prueba t de Students para series pareadas con un nivel de significación de a = 0,05.

Similar análisis hicimos con los resultados hallados empleando ambos RIAs (extractivo y directo) con trazador radiactivo yodado.

RESULTADOS

Al realizar la titulación del antisuero para el RIA con extracción, escogimos como dilución de trabajo 1:900 000 (figura 3) pues ofreció una unión máxima específica adecuada para el ensayo (30-35 %), con una dilución final de 1:6 300 000.

La dilución de trabajo seleccionada a partir de la curva de titulación del antisuero en presencia de 400 ng de danazol/tubo (ensayo directo) fue de 1:675 000 (figura 3), ya que brindó una unión máxima específica acorde con las condiciones de trabajo (30-35 %); la dilución final fue de 1:4 725 000. La preparación del trazador radiactivo resultó efectiva. En su purificación se obtuvieron 3 picos de radiactividad, más del 90 % de la misma estuvo confinada al tercero de ellos, comprendido entre las fracciones 8 y 12, que coincidió con un pico de absorbancia a una longitud de onda de 254 nm (figura 4).

Al probarse la inmunorreactividad de todas las fracciones, solamente las correspondientes al pico señalado anteriormente, arrojaron unión máxima específica y unión no específica adecuadas (esta última menor del 5 %). El rendimiento promedio obtenido de 5 marcajes fue de 90,1 ± 3,6 % con una actividad específica de 20,5 ± 0,8 mCi/mg de progesterona-11-hemisuccinato.

El resto del cromatograma no fue caracterizado; pero, de acuerdo con las condiciones de hidrofobicidad empleadas y los resultados reportados por otros autores que han caracterizado los mismos,8 es posible inferir que se trató de una mezcla de I125, histamina-125 histamina libre, derivado hemisuccinato del esteroide libre y complejo progesterona-11-hemisuccinato-histamina no radiactivo. A partir de 20 curvas dosis-respuestas se confeccionó una curva promedio para cada ensayo (figuras 5 y 6) y los parámetros de las mismas resultaron satisfactorios en ambos casos (tabla 1).
 

TABLA 1. Parámetros de las curvas dosis-respuestas promedio (n = 20) de los radioinmunoanálisis (extractivo y directo) para cuantificar progesterona plasmática con trazador radiactivo yodado

RIA extractivo
RIA directo
Parámetro
_ ± DE
CV (%)
_ ± DE
CV (%)
Unión específica (% Bo/T)
30,7 ± 3,10
10,09
34,2 ± 3,6
10,52
Unión no específica (% UNE)
3,8 ± 0,60
15,38
3,9 ± 0,7
17,94
Pendiente -0,904 
4 ± 0,12
13,26 -0,931
4 ± 0,08
9,66
Intercepto 
-0,27 ± 0,9
33,33 
-0,25 ± 0,09
36,00
ED-50 
0,47 ± 0,08
17,20 
0,49 ± 0,09
18,36
Las sensibilidades de los ensayos fueron de 1,32 pg/tubo en el RIA extractivo y de 28,17 pg/tubo en el ensayo directo, ambos comparables con las reportadas en la literatura.10,11,16

En el ensayo de paralelismo hallamos, para el RIA extractivo, que no existían diferencias significativas ni entre las varianzas ["test" F de Fischer = 1,107, F(4,4) a 0,05 = 6,39], ni entre las pendientes ["test" t de Students = 0,009, t(8) a 0,05 = 1,8] al realizar un análisis de regresión para rectas de primera clase a las curvas dosis-respuesta y la realizada con diferentes diluciones de una muestra problema, con lo cual se demostró que ambas eran paralelas14 (figuras 7 y 8).

Efectuamos el mismo análisis estadístico descrito anteriormente, para el RIA directo, y observamos que entre ambas rectas no existían diferencias significativas ni entre las varianzas ["test" F de Fischer = 1,213, F(4,4) a 0,05 = 1,213, F(4,4) a 0,05 = 6,29] ni entre las pendientes ["test" t de Students = 0,005, t(8) a 0,05 = 1,85], lo cual demostró que existía igualmente para-lelismo14 (figura 6).

Para el método con extracción, los ensayos efectuados con el pool de concentración conocida, arrojaron valores de coeficientes de variación intra e interensayo desde 7,14 a 8,18 % y de 12,54 a 18,35 % para el intra e interensayo, respectivamente (tabla 2), esto indicó una buena repetibilidad y reproducibilidad para este RIA.

TABLA 2. Coeficiente de variación intra e interensayos de los pools de concentraciones conocidas (zonas baja, media y alta de las curvas dosis-respuestas) y resultados de los ensayos de recuperación

RIA extractivo
RIA directo
Muestras de concentración conocida
 Bajo
Medio
Alto
Bajo
Medio
Alto
Concentración (nMol/L) (_±2DE)
0,171±0,028
0,532±0,076
1,302±0,192
0,202±0,025
0,633±0,072
2,493±0,284
CV intraensayo (%)
8,18
7,14
7,37
6,18
5,51
5,69
Concentración (nMol/L) (_±2DE)
0,176±0,066
0,510±0,127
1,388±0,371
0,215±0,059
0,650±0,144
2,314±0,550
CV interensayo (%)
18,35
12,54
13,36
13,72
11,07
11,88
Intraensayo: 12 veces en un mismo ensayo
Interensayo: 5 veces en un mismo ensayo
Recuperación (%)
94,14±5,25
91,00±5,03
93,16±4,25
98,51±3,45
98,70±3,27
98,20±3,05
y = 1,29x - 1,25 y = 1,01x - 2,25,  r = 0,989, n = 4 r = 0,976, n = 4

En el caso del ensayo directo, los coeficientes de variación intra e interensayos obtenidos estuvieron desde 5,51 a 6,18 % y 11,07 a 13,72 % para el intra e interensayo, respectivamente (tabla 2), ello indicó una mejor repetibilidad y reproducibilidad (mejor precisión) de este RIA con respecto al ensayo extractivo. El ensayo de recuperación del método con extracción brindó resultados satisfactorios pues el porcentaje (%) de recobrado osciló entre el 91 y el 94 % (tabla 2). La ecuación encontrada al ajustar una recta de regresión entre el Log de las cantidades recobradas por el ensayo (abcisas) y el Log de las cantidades añadidas (ordenadas)14 fue y = 1,29x - 1,25 con un coeficiente de correlación de r = 0,989.

Para el RIA directo, los resultados de este experimento fueron igualmente adecuados, pues, el porcentaje de recobrado estuvo entre el 98,20 y el 98,70 % (tabla 2) y la recta ajustada siguiendo un procedimiento similar al descrito anteriormente fue y = 1,01x -2,25 con un coeficiente de correlación de r = 0,976.

Al comparar los valores de las muestras procesadas con el RIA extractivo y con el juego de reactivos del Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO) obtuvimos una buena correlación (y = 0,9908x + 0,871, r = 0,9806) y no se hallaron diferencias significativas al aplicar una prueba t de Students para muestras pareadas (p < 0,05).

Similarmente, al comparar los valores hallados utilizando los RIAs extractivo y directo en proceso de validación, encontramos una buena correlación (y = 0,9281x + 1,4216, r = 0,9631) y tampoco hubo diferencias significativas al aplicar la prueba t de Students para muestras pareadas (p < 0,05).

DISCUSION

En la preparación del trazador radiactivo yodado obtuvimos un rendimiento considerablemente superior al reportado por los autores de la técnica8 y por otros investigadores que la han empleado con posterioridad,17 quienes no encontraron que éste fuera superior al 50 %.

El resultado obtenido por nuestro grupo de trabajo es lógico si se tiene en cuenta la modificación introducida en el paso de purificación del trazador radiactivo, pues son bien conocidas y demostradas18 las ventajas que presenta la cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en cuanto a rapidez, repetibilidad, reproducibilidad y pérdidas mínimas de material radiactivo sobre la cromatografía en capa delgada empleada por los autores originales.8

En la validación de ambos RIAs no se hallaron diferencias significativas en el análisis de paralelismo, lo cual indicó que no existen sustancias que interfieran de forma notable si la cuantificación de progesterona se realiza con distintas diluciones de una muestra; hecho muy importante para el ensayo directo, donde al eliminarse la fase extractiva con solventes orgánicos, quedan presentes en la muestra sustancias que pudieran provocar uniones inespecíficas del antisuero o el trazador radiactivo y ocasionar inexactitud en el resultado final.19

Los coeficientes de variación intra e interensayo obtenidos para ambos (extractivo y directo) apuntaron hacia una buena precisión de ambos RIAs, con menores coeficientes de variación para el ensayo directo, lo cual es lógico ya que al eliminar la fase extractiva, se simplifica el proceder.10 Dichos resultados estuvieron acordes con los reportados en la literatura para técnicas que conllevan extracción con solventes orgánicos de tipo isotópico y no isotópico.6,11,16

Los resultados hallados en los ensayos de recuperación demostraron que ambos presentan una buena exactitud y estuvieron acordes con los hallazgos de otros grupos de investigadores para los de tipo extractivos11,19 y para RIAs directos.6,10,16,20

Los resultados obtenidos en la comparación del RIA extractivo y el juego de reactivos del Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO) coincidieron con lo consultado en la literatura,9 aunque los valores determinados utilizando el ensayo con trazador yodado fueron, en sentido general, algo superiores a los arrojados por el ensayo que emplea trazador radiactivo tritiado (HRP/WHO), similar a lo reportado en la literatura por otro grupo de investigadores.9

Los resultados hallados en la comparación de ambos ensayos (extractivo y directo) indicaron que no existen diferencias significativas entre ellos y concuerdan con lo encontrado por otros autores;10,20 aunque los valores determinados por el ensayo directo fueron algo superiores, lo cual también fue reportado por otros grupos de investigadores.10,20

Estos resultados indicaron que los radioinmunoanálisis (extractivo y directo) de acuerdo con sus sensibilidad, precisión, exactitud y rapidez pudieran ser utilizados en la clínica de infertilidad para cuantificar los niveles plasmáticos de progesterona.

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo fue financiado, en parte, por el Programa Especial de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO) y el Programa Latinoamericano para la Capacitación e Investigación en Reproducción Humana (PLACIRH) nos posibilitó su culminación.

SUMMARY

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

  1. Lipsett MB. Steroids hormones. En: Yen SSC, Jaffe RB. Reproductive Endocrinology. Physiology, Pathology and clinical management. Philadelphia: Saunders, 1986:140-53.
  2. Hull MGR, Savage PE, Bromhan DR, Ismail AAA, Morris AF. The value of a single serum progesterone measurement in the midluteal phase as a criterion of a potentially fertile cycle ("ovulation") derive from treated and untreated conception cycles. Fertil Steril 1982;37:355-60.
  3. Hammond MG, Talbert LM. Clomiphene citrate therapy on infertile women with low luteal phase progesterone levels. Obstet Gynecol 1982;59:274-9.
  4. Wu Ch, Minassian SS. The integrated luteal progesterone: an assessment of luteal function. Fertil Steril 1987;48:937-40.
  5. Di Zerega GS, Hodgen GD. The primate ovarian cycle suppresion of human menopausal gonadotropin-induced follicular growth in the presence of the dominat follicle. J Clin Endocrinol Metabol 1990;50:819-25.
  6. Blight LF, White GH. 125I-labelled radioimmunoassay kits for progesterone evaluated for using in a In Vitro Fertilization Program Clin Chem 1983;29:1024-7.
  7. Thorell JI, Ekman R, Malmquist M. Technical aspects of the production and application of iodinated steroid for radioimmunoassay. Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine. Proceedings of a Symposium. Viene, June 21-25, 1982. IAEA, Viena, 1982:147-60.
  8. Nars PW, Hunter WM. A method for labelling oestradiol-17B with radioioline for radioimmunoassay. J Endocrinol 1973;57:42-3.
  9. Allen RM, Redshaw WR, Holsworth R. A comparison of triated and iodinated tracers in the radioimmunoassay of progesterone in cow milk. J Reprod Fertil 1980;58:89-93.
  10. Ratcliffe WA. Direct (non-extration) serum assay for steroids. En: Hunter WM, Corris JET eds. Immunoassay for clinical chemistry. Livingstone: Churchill, 1983:401-9.
  11. WHO. Special programme of research. Development and research training in human reproduction programe for the provision of matched assay reagents for the radioimmunoassay of hormone in reproductive physiology. Method Manual, 19 ed. Londres: HRP/WHO, 1995:36-45.
  12. Dunn JF, Nisula BC, Rodbard D. Transport of steroid hormones: Binding of 21 endogenous steroids to both testosterone-binding globuling and corticosteroid-binding globulin in human plasma. J Clin Endocrinol Metabol 1981;53:68-9.
  13. Ekins RP. Basic concepts in quality control. Radioinmonoassay and related procedures in medicine. Proceeding of a Symposium; 1977 Oct. 31-nov. 4; Berlin, Viena: IAEA, 1978:6-20.
  14. Rodbard DM. Mathematic and statistic of ligand assay: an illustrated guide. En: Lagan J, Calpp JJ, eds. Analysis od international development on isotopic and monisotopic immunoassay. New York: Masson, 1981:45-101.
  15. Thileman K. Métodos analíticos. Selección, montaje, caracterización. En: Principios de Metodología en Bioquímica Clínica. La Habana: Editorial Organismos, 1973:54-69.
  16. WO. Matched Reagent Programme. Draft Protocol for Direct Two-Step, progesterone enzymeimmunoassay. Londres: HRP/WHO, 1994,13-5.
  17. Cameron EHD, Scarisbrick JJ, Morris SE, Read G. 125I-Iodohistamine derivates as tracers for the radioimmunoassay of progestagens. Steroid Immunoassay. En: Cameron EH, Hillier SG, Griffiths Kieds. Proceedings of the Fifth Tenovus Worshop. Cardiff, 1974 April eds. EHD cameron, SG Hillier, K Griffiths. Wales: Alpha Omega, 1975;153-76.
  18. Andres RY. Iodination tracers for radioimmunoassays preparation and purification. Radioimmunoassay and Related Procedures in Medicine. Procedings of a Symposium; 1982 June Berlin Viena: IAEA, 1982:133-46.
  19. Jeffcoate SL. Standarization desing and ruggedness of immunoassay methods. Efficiency and effectiviness in the endocrine laboratory. New York: Academic 1981;150-70.
  20. Haynes SP, Corcoran JM, Eastman CJ, Doy Fa. Radioimmunoassay of progesterone in unextrated serum. Clin Chem 1980;26:1607-9.
Recibido: 13 de julio de 1995. Aprobado: 17 de noviembre de 1995.

Lic. Amparo Teresa Niesembaum Alas. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y D, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

Indice Anterior Siguiente