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Rev Cubana Endocrinol 1997;8(3):176-83

Trabajos Originales

Instituto Nacional de Endocrinología

Evaluación de un anticuerpo monoclonal antigonadotropina coriónica para detectar embarazo

Lic. María Celeste Arranz Calzado, Lic. Ileana Almeida Rodríguez, Lic. Bertha Rodríguez Pendás,1 Lic. Rosa de Dios Despaux, Lic. Julio César Rodríguez García,3 Lic. Gema García Dafonte1 y Dr. Roberto M. González Suárez

RESUMEN

Se evaluó el anticuerpo monoclonal B8 producido en el INEN para ser utilizado en el desarrollo de un método analítico para detectar embarazo. Los resultados de este método fueron evaluados utilizando como referencia los métodos tradicionales como tacto vaginal y biopsia de endometrio. Se encontró que es capaz de detectar el embarazo con 80 % de sensibilidad y 100 % de especificidad. El anticuerpo monoclonal validado B8 cumple con los requisitos de calidad para ser utilizado en el método inmunoenzimático con que contamos pues los resultados obtenidos no dieron diferencias significativas con el monoclonal en uso.

Descriptores DeCS: ANTICUERPOS MONOCLONALES; GONADOTROPINAS CORIONICAS/orina; TEST DE EMBARAZO/métodos; TEST DE ELISA/métodos; EVALUACION.

La gonadotropina coriónica humana (HCG) es una hormona glicoproteíca que en condiciones normales se produce solamente en las células trofoblásticas de la placenta.1 Al igual que otras hormonas glicoprotéicas, está compuesta por 2 polipéptidos, alfa y beta.2 La subunidad alfa es similar a la de otras 3 hormonas glicoprotéicas de origen hipofisiario: hormona luteinizante (LH), hormona folículo estimulante (FSH) y la estimu-lante del tiroides (TSH). Las cadenas beta le confieren a dichas hormonas sus características biológicas e inmunológicas distintivas.2-4

La HCG se forma en la placenta poco después de la implantación del embrión y puede detectarse a partir de ese momento en el suero y en la orina maternas.5

El principal uso de la determinación de la HCG es en el diagnóstico precoz del embarazo.5-7 Sin embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas gastrointestinales,8 urogenitales, 9,10 bronquiales y mamarios; cáncer testicular, ovárico, cervix11-15 y en los linfomas.16

Para determinar HCG en suero u orina han sido utilizados diferentes métodos, en sus inicios los ensayos inmunológicos mediante los métodos de hemoaglutinación, latex-aglutinación, radiorreceptores, etc.17,18 resultaron de poca sensibilidad, por tal motivo fueron sustituidos por ensayos inmunoquímicos altamente sensibles, pero que presentaban reacción cruzada con otras hormonas glicoprotéicas, sobre todo con la LH, hasta que se incorporaron los anticuerpos monoclonales a estos ensayos.

Gracias a la posibilidad de la producción de anticuerpos monoclonales (AcM) contra la subunidad beta HCG, se han desarrollado ensayos altamente específicos, que han hecho posible la cuantificación exacta de bajas concentraciones de HCG con niveles insignificantes de reacción cruzada con la LH.19-21

En nuestra institución se desarrolló un método para la determinación cualitativa de betaHCG,22 con el empleo de un AcM altamente específico, debido a que dicho AcM posee características estructurales que dificultan su manipulación, se obtuvieron nuevos hibridomas productores de AcM GB3 y GB8, los cuales fueron caracterizados.23 De acuerdo con los resultados presentados previamente se escogió uno, el anti HCG GB8 o B8 que, utilizado en el proceso de validación, mostró cumplir con los parámetros de especificidad y afinidad necesarios para su incorporación en estos métodos.

En este trabajo se describen los resultados de la caracterización de dicho AcMo, su comparación con el que estaba en uso y los resultados de un estudio en el terreno para ser empleado en un método para el diagnóstico precoz del embarazo.

MÉTODOS

El método inmunoenzimático para detectar HCG es del tipo sandwich y utiliza muestras de orina. En este ensayo, la HCG es capturada por un anticuerpo policlonal anti-HCG de alta afinidad inmovilizado en la fase sólida (tira o placa de poliestireno). La reacción se completa con la adición de un AcM anti beta HCG y la inmunorreaccción se revela con un conjugado de anticuerpo antiglobulina de ratón purificado por afinidad, con enzima peroxidasa y su correspondiente sustrato colorigénico el cual desarrolla una coloración directamente proporcional a la concentración de la HCG en la muestra.

Universo de trabajo

Para el desarrollo de la validación en el terreno utilizamos 50 muestras de orina provenientes de pacientes de la consulta del Hospital Ginecoobstétrico "Ramón González Coro" con edades comprendidas entre los 16 y 35 años, que presentaban una amenorrea de entre 4 y 6 semanas. Les indicamos recoger la primera orina de por la mañana del día de la interrupción y además recogimos material biológico del endometrio, el cual enviamos al Departamento de Anatomía Patológica para su análisis y diagnóstico del embarazo. Como criterio de certeza de embarazo utilizamos el examen ginecológico y la biopsia endometrial. Guardamos muestra de orina para procesarla por el método inmunoenzimático cualitativo (ELISA).

Materiales químicos y biológicos

Para la determinación cualitativa de HCG de las muestras colectadas utilizamos el Kit de ELISA cualitativo estandarizado anteriormente en el INEN,22 compuesto por los reactivos que detallamos en el procedimiento del ensayo y además, por el nuevo AcM anti HCG que queremos evaluar (B8), sustituyendo el que componía el KIT (IG1) por este anticuerpo purificado.

Purificación del anticuerpo monoclonal B8

Este AcM lo obtuvimos y purificamos a partir de líquido ascítico de ratones inoculados con el hibridoma productor del AcM en cuestión.23,24 La purificación fue en columna de afinidad de proteína G según describimos a continuación:

Equilibramos la columna de proteína G con tampón fosfato a un flujo de 30 mL/h, luego aplicamos el líquido ascítico previamente centrifugado, colectamos la fracción que no se pegó a la columna y luego aplicamos glicina 0,1 pH 2,7 -para desprender la fracción pegada, la recolectamos en tubos que contenían tampón Tris 1 M pH 9,0- para neutralizar y evitar desnaturalización del anticuerpo.

Leímos las fracciones en espectrofotómetro a 280 nm, colectamos el pico de mayor densidad óptica y lo dializamos contra tampón salino (PBS). Determinamos su concentración de proteínas por Lowry25 y por DO a 280 nm según el coeficiente de extinción. Evaluamos su capacidad de unión con HCG marcada con I125 (RIA),19 además de cuantificar las IgG específicas por el ELISA de IgG antirratón para su evaluación posterior en el ELISA de HCG a concentraciones diferentes.

Procedimiento del ensayo inmunoenzimático (ELISA)

En placas de polivinilo de 96 pozos recubiertas con 100 mL de anti-HCG policlonal purificado (10 mg/mL), añadimos 50 mL de muestra de orina de las pacientes o de controles, conjuntamente con 50 mL de AcM anti-HCG (IG1 ó B8). Lo incubamos 15 min a temperatura ambiente, en oscuridad y pasado este tiempo lavamos la placa 3 veces con tampón Tris-Tween, añadimos 100 mL de conjugado anti-ratón-peroxidasa. Lo incubamos 15 min a temperatura ambiente, en oscuridad y luego, lo volvimos a lavar de igual forma.

La reacción de color se produjo al añadir 100 mL de sustrato de ortofenilendiamina 400 mg/mL a cada pozo e incubar 15 min, la reacción se detuvo con 20 mL de ácido sulfúrico 2,5 N. Medimos la densidad óptica en espectrofotómetro del equipo SUMA modelo 121.

Sistema de evaluación de los resultados

Para el diagnóstico de rutina, comparamos los resultados obtenidos con cada muestra con los colores desarrollados por los controles, tanto positivo (100 UI/mL) como negativo (6 UI/mL).

El diagnóstico de embarazo se hace cuando el color desarrollado es superior al del control negativo y tiende a ser similar o superior al control positivo.26 Los casos donde no se puede establecer claramente este criterio se reportan como dudosos.

En este trabajo, también evaluamos los resultados mediante las lecturas de las densidades ópticas, como parte del proceso de validación para hacer el análisis estadístico de los controles con ambos AcM (IG1 y B8) para lo cual, aplicamos un paquete estadístico del programa MICROSTA de la computadora, con el análisis de estadística descriptiva y comparación de medias.27

RESULTADOS

Al AcM B8 purificado por cromatografía de afinidad, como se detalló anteriormente, lo comparamos con el AcM utilizado en el KIT IG1 en la tabla 1 donde podemos ver los resultados del control analítico que seguimos, tanto antes de purificar el líquido ascítico, como después del proceso; los resultados fueron similares por lo cual calculamos la dilución de trabajo para una concentración del anti HCG B8 de 10 mg/mL al igual que se utiliza con el anterior anti HCG para su uso en los ensayos de ELISA con las muestras y controles.
TABLA 1. Control analítico de la purificación de los anticuerpos monoclonales IG1 y B8
 
AcM
IG1
AcM
B8
 
Antes de la purificación
Después de la purificación
Antes de la purificación
Después de la purificación
IgG/ELISA
1,2
0,7
5,2
1,5
Proteína/Lowry
2,7
0,62
3,2
0,64
RIA (%)
24
25
36
30
Proteína/DO-280 nm
-
0,42
-
0,64
Unidad de medida:mg/ml.

En la tabla 2 se observan los resultados de la comparación del control de calidad, o sea, el control positivo y negativo con ambos AcM al medirles las densidades ópticas (n=15), no hubo diferencias significativas en las medias de éstas, ni en los demás parámetros analizados.

TABLA 2. Control de calidad ELISA-HCG-cualitativo
 
AcM C (+)
IG1 C (-)
AcM C (+)
B8 C (-)
n
15
15
15
15
_ (DO) nm
0,780
0,300
0,700
0,300 DE
0,070
0,070
0,110
0,07
n: número de casos. _ (DO): Media de las densidades ópticas. DE: Desviación estándar. D0: 280 nm.

En la tabla 3 se muestra el total de los casos estudiados con todos los resultados expresados según los criterios de embarazo que fueron: biopsia endometrial, tacto vaginal (TV) y el método analítico ELISA que queremos evaluar mediante el empleo de los 2 AcM. La biopsia de endometrio obtenida por la regulación menstrual por aspiración fue nuestro criterio de certeza para comparar los resultados de las muestras.

TABLA 3. Resultados de los 3 métodos diagnóstico de embarazo utilizados en 50 pacientes
Muestra #
Biopsia
TV
ELISA
Muestra #
Biopsia
TV
ELISA
1
+
+
6
26
-
-
-
2
+
+
5
27
+
+
6
3
-
+
6
28
+
+
4
4
+
+
6
29
-
-
-
5
-
-
-
30
-
-
5
6
+
+
6
31
+
+
-
7
-
-
-
32
+
+
6
8
+
+
6
33
+
+
5
9
+
+
6
34
+
+
-
10
+
+
5
35
+
+
6
11
+
+
5
36
+
+
5
12
+
+
5
37
-
+
4
13
-
-
-
38
+
+
6
14
+
+
5
39
+
+
5
15
-
-
-
40
+
+
6
16
+
+
5
41
+
+
5
17
+
+
5
42
+
+
7
18
+
+
6
43
+
+
7
19
-
-
-
44
+
+
6
20
+
+
6
45
+
+
5
21
+
+
5
46
+
+
7
22
+
+
6
47
+
+
6
23
+
+
5
48
+
+
7
24
+
+
4
49
+
+
7
25
+
+
5
50
+
+
7
TV: Tacto vaginal.

No hubo ningún caso contradictorio entre ambos AcM por lo que en la tabla 4, analizamos los criterios de especificidad y sensibilidad en común para ambos. Los resultados anteriores muestran un alto porcentaje de especificidad, 80 % y 100 % de sensibilidad al utilizar el método inmunoenzimático en la detección del embarazo, al ser comparados con los de la biopsia.

TABLA 4. Evaluación de la especificidad y de la sensibilidad del diagnóstico
 
Biopsia
 
 
(-)
(+)
Total
ELISA
8
42
50
 
6
44
50
Falsos
(+)
(FP) =2
 
Falsos
(-)
(FN) =0
 
Verdaderos negativos (VN) = 8
Verdaderos positivos (VP) = 42
Especificidad:     VN             =     8      = 80 %
                      VN + FP           8 + 2
Sensibilidad:     VP       =     42   = 100 %
                   VP + FN     42 + 0
 

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos demuestran que el nuevo AcM que se produjo cumple los requisitos para los cuales fue creado o diseñado. El objetivo de la producción de AcM es precisamente elegir, entre el número casi ilimitado de inmunoglobulinas que surgen como respuesta a la inmunización, la posibilidad de detectar, escoger y producir en cantidades ilimitadas sólo aquellas que se ajusten a las necesidades planteadas en el momento del diseño.23-28

Entre estas necesidades, además de la estabilidad, se desea desarrollar un sistema de alta especificidad de tipo cuantitativo con la combinación de ambos AcM, o sea que no reconozca ninguna molécula que no sea la HCG, y que ignore a la LH, con la cual tiene tantas semejanzas estructurales la HCG, tanto en la cadena alfa como en la beta. La reactividad cruzada con LH pudiera hacer confundir una amenorrea posmenopáusica donde la LH está elevada, con un embarazo.26,29

Resultados anteriores reportados en otros trabajos,19,22-24 confirman la especificidad de ambos AcM. Tanto el IG1 como el B8 fueron estudiados frente a las hormonas glicoprotéicas de cadena alfa común como LH, FSH y TSH y quedó demostrada la ausencia de reacción cruzada con éstas.

Los resultados presentados muestran el alto porcentaje de especificidad (100 %), pues no hubo ningún resultado falso negativo, con respecto a la biopsia.26

En el caso de la sensibilidad, esta nos dió un 80 % contra el método de referencia, ya que 2 de los casos positivos, resultaron ser negativos por la biopsia, no así por el tacto. Esto pudiera explicarse teniendo en cuenta que no siempre el material recolectado de la aspiración, que se analiza, es totalmente confiable debido a las condiciones en que se realiza este método.

Además, en estos 2 casos falsos positivos se detectó por tacto, 4 y 5 semanas de embarazo respectivamente, por lo que en este caso sería 100 % de sensibilidad.26,27 Todo esto confirma la utilidad de este nuevo monoclonal en dicho método inmunoenzimático, es una alternativa más en el desarrollo de nuestra propia tecnología, además en el futuro puede contribuir a cambios o sustituciones del anticuerpo policlonal que se utiliza, o de nuevos métodos no instrumentales que pueden ser desarrollados al contar con 2 AcM.

Podemos concluir que el AcM validado B8 cumple con los requisitos de calidad para ser utilizado en el método inmunoenzimático con que contamos, pues los resultados no dieron diferencia significativa con el monoclonal en uso.

La alta especificidad y sensibilidad encontradas con el uso de estos anticuerpos confieren al método una alta confiabilidad y utilidad en el diagnóstico del embarazo, superior a otros métodos empleados.

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos la valiosa colaboración de los doctores Jaimee Saavedra e Isabel Fundora del Hospital Gineco-obstétrico "Ramón González Coro", pues sin ellos no hubiera sido posible la realización de este trabajo, así como a las compañeras María del Carmen Rodríguez y Lucía Parets por su eficiente colaboración técnica.

SUMMARY

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 

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Recibido: 29 de enero de 1997. Aprobado: 30 de abril de 1997.

Lic.María Celeste Arranz Calzado. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y C, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba, CP 10400.

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