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Rev Cubana Endocrinol 1997;8(3):184-91
Instituto Nacional de Endocrinología

Evaluación en condiciones de rutina, de un microelisa para determinar microalbuminuria

Lic. Amparo Teresa Nisembaum Alas, Lic. Gema García Dafonte, Lic. María Celeste Arranz Calzado,2 Dr. Rubén René González y Dr. Roberto M. González Suárez

RESUMEN

Se realizó este trabajo para evaluar el funcionamiento, en condiciones óptimas y de rutina, de un microelisa para determinar microalbuminuria, desarrollado en el Instituto Nacional de Endocrinología. Los coeficientes de variación intra e interensayo del control de calidad alto; así como los parámetros de la curva estándar durante la validación en condiciones óptimas estuvieron acordes con lo reportado para estos métodos; sin embargo, en condiciones de rutina, se hallaron para los controles de calidad bajo y alto, variaciones aleatorias que incidieron sobre la precisión del ensayo. Para robustecer el método se sugiere: utilizar agua de calidad analítica tipo I, reajustar la curva dosis-respuesta o desarrollar un ELISA tipo "sandwich".

Descriptores DeCS: TEST DE ELISA/métodos; ALBUMINAS/análisis; CONTROL DE CALIDAD; ALBUMINURIA/orina.

Es necesario determinar la excreción renal de proteínas para el diagnóstico, investigación y seguimiento de las afecciones nefrológicas.1-3

La albúmina de suero humano (ASH) es una de las moléculas más pequeñas, casi totalmente excluida por la membrana glomerular intacta.1,2 Detectar su excreción tiene relevante importancia en el diagnóstico precoz de la proteinuria en las enfermedades renales, lo cual permite tomar medidas terapéuticas antes de que el daño sea irreversible.1-4

Se han desarrollado ensayos inmunoturbidimétricos,5 ensayos radioinmunoanalíticos (RIA)6 y, con posterioridad, ensayos inmunoenzimáticos (ELISA)7 para cuantificar esta proteína.

El objetivo del presente trabajo es evaluar, en condiciones óptimas y de rutina, un microelisa competitivo para detectar microalbuminuria (ASH), desarrollado en el Instituto Nacional de Endocrinología, Ciudad de La Habana, Cuba, en el período comprendido entre diciembre de 1994 y el propio mes de 1995, para lo cual se utilizó el paquete de Programas RIACALC2 RM, versión 2,65 de la Pharmacia, Wallac.8

MÉTODOS

Procedimiento del ensayo

Determinamos la albúmina humana en orina mediante un microelisa competitivo.7

Recubrimos placas de poliestireno de 96 pocillos con 100 mL de una solución de un anticuerpo antialbúmina policlonal purificado por cromatografía de afinidad (albúmina humana acoplada a CnBr-Sepharosa 4B7) con una concentración 5 mg/mL disuelto en tampón bicarbonato 0,01 M, pH = 9,6 y lo dejamos incubar 18 h a temperatura ambiente.

Concluidas éstas, realizamos 3 lavados con tampón Tris-Tween (Tris 14,8 mM, NaCl 0,15 M, 0,05 % Tween 20 %, pH = 7,8) y estabilizamos con 100 mL de una solución de albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % y sacarosa al 5 % durante 1 h a temperatura ambiente, luego de la cual, decantamos la solución y quedaron listas las placas para la reacción inmunoenzimática.

Paralelamente, tomamos 20 mL de la muestra (orina de 24 h, conservada a -20 °C sin preservo alguno y diluida 1:50 con tampón Tris-Tween) ó de la solución estándar y les añadimos 200 mL de un conjugado de ASH-peroxidasa, preparado según el método descrito por Nakane y Kawaoi 9 y conservado a -20 °C con BSA al 1 % y glicerol al 50 %. Agitamos esta mezcla en zaranda durante 3 min al cabo de los cuales tomamos 100 mL que adicionamos a las placas recubiertas.

Lo incubamos 2 h a 37 °C. Concluidas éstas, adicionamos 100 mL del sustrato (ortofenildiamina 0,04 % en tampón fosfato 0,2 M, citrato 0,1 M, H2O2 0,012 %, pH= 5,0) y dejamos transcurrir 30 min a temperatura ambiente antes de detener la reacción con 20 mL de H2O4 2,5 M.

Al final, leímos la densidad óptica a la longitud de onda de 492 nm en lector de placas modelo PR-521.

Realizamos los cálculos con el empleo del paquete de programas RIACALC2, RM, versión 2,65 de la Pharmacia-Wallac8 instalado en una computadora personal IBM compatible 486 con un ajuste Spline10 para la curva dosis-respuesta donde graficamos el porcentaje de desplazamiento con respecto a la unión máxima (% B/Bo)11 contra el logarítmo de las concentraciones.

Control de calidad

Estudiamos las variaciones en condiciones óptimas, realizamos experimentos de repetibilidad (n=12) y reproducibilidad (n=10) a los controles de calidad bajo (0,6 mg/L de ASH) y alto (5 mg/L de ASH) preparados a partir de la orina de 24 h de un paciente nefrótico y que fue filtrada, dispensada en bulbos de cristal con capacidad para 10 mL y posteriormente liofilizada. Los bulbos fueron resuspendidos con tampón Tris-Tween en el momento de realizar el ensayo.7

Evaluamos el ensayo en condiciones de rutina, para ello, recogimos todos los ensayos realizados en el año de trabajo, comprendido entre diciembre de 1994 y el propio mes de 1995, con fines asistenciales y realizamos los análisis dividiendo éste en 4 períodos que fueron los siguientes: diciembre de 1994-febrero de 1995; marzo-mayo de 1995; junio-agosto de 1995 y septiembre-diciembre de 1995.

Dibujamos, para los 2 controles de calidad, las tarjetas controles de la reproducibilidad12 en las cuales subdividimos las ordenadas según las medias (x) y las desviaciones estándares (DE) obtenidas durante la validación de los controles de calidad. Colocamos los valores de cada día como puntos sobre las abcisas (días). El 95 % de los valores debió encontrarse en el rango x ± 2DE, que estuvo entre 0,25-0,97 mg/mL para el control bajo y 3,92-7,39 mg/mL para el control alto.

Analizamos la precisión (repetibili-dad y reproducibilidad) de los controles de calidad bajo y alto a través del porcentaje de coeficiente de variación (% CV); así como, la reproducibilidad de los parámetros del ajuste de la curva están-dar y la presencia con el uso del paquete de Programas RIACALC2 RM, versión 2,65 de la Pharmacia-Wallac9 con el ajuste de Spline10 para la curva dosis-respuesta.

RESULTADOS

Los resultados correspondientes a la reproducibilidad de los parámetros de la curva dosis-respuesta en condiciones óptimas del ensayo y los hallados durante el año de trabajo se muestran en la tabla.

TABLA. Coeficientes de variación interensayo de los parámetros del ajuste curva dosis-respuesta en condiciones óptimas y de rutina

 
Condiciones de rutina (dic, 1994-dic.1995)
 
Condiciones óptimas
Dic-Feb
Mar-May
Jun-Ag
Sept-Dic
Parámetros 
(n = 10)
(n = 18)
(1 = 12)
(n = 10)
(n = 16)
Pendiente
16,0 %
11,2 %
27,2 %
19,9 %
17,5 %
ED-20 
-
21,3 %
30,1 %
32,3 %
21,8 %
ED-50
2,2 %
13,6 %
20,4 %
16,7 %
28,1 %
ED-80
-
18,5 %
51,6 %
41,6 %
48,8 %
En cuanto a estos resultados, encontramos que, en condiciones de rutina, los parámetros ED-50 y ED-20 que se corresponden con valores de ASH entre 0,3 y 1,5 mg/dL (equivalentes a concentraciones de ASH en orina entre 15 y 75 mg/mL) mantuvieron un comportamiento aceptable para estas condiciones de trabajo.11,13,14

Los datos correspondientes a los valores del ED-20 y ED-80 para las condiciones óptimas del ensayo no se muestran debido a que es relativamente reciente la introducción del paquete de programas RIACALC2 RM para el procesamiento de los resultados.

En cuanto a los controles de calidad bajo (0,6 mg/L de ASH) y alto (5 mg/L de ASH), los resultados obtenidos tanto en la validación del ensayo en condiciones óptimas como en las condiciones de rutina (durante 1 año) se muestran en la figura 1.

Figura 1
Figura 1
FIGURA 1. Coeficientes de variación intra e interensayo de los controles de calidad (bajo y alto) en condiciones óptimas y de rutina.

Tanto durante la validación en las condiciones óptimas como en el primer período comprendido entre diciembre de 1994 y febrero de 1995, solamente se muestran los datos del control de calidad alto debido a que el control de calidad bajo lo comenzamos a utilizar a partir del mes de marzo de 1995.

Durante la validación del ensayo en condiciones óptimas, los resultados del control de calidad alto estuvieron acordes con los reportados para este tipo de inmunoensayo competitivo,13,14 mientras que cuando utilizamos el ensayo en las condiciones de rutina encontramos que en todos los períodos analizados los controles de calidad se mantuvieron dentro de los rangos definidos (control bajo: 0,25-0,97 mg/mL; control alto: 3,92 - 7,39 mg/mL) sin presentar diferencias significativas (p < 0,05) con respecto a éstos ni se detectaron variaciones sistemáticas dentro del ensayo (figura 2). Sin embargo, hubo variaciones aleatorias que incidieron significativamente (p £ 0,05) sobre la repetibilidad (períodos marzo-mayo y junio-agosto) y fundamentalmente, sobre la reproducibilidad (con excepción del período junio-agosto) y hallamos valores de coeficientes de variación superiores a los descritos para estos tipos de ensayos.13-15

Figura 2
Figura 2
FIGURA 2. Curvas de control de reproducibilidad de los controles de calidad bajo y alto durante el período comprendido entre diciembre de 1994 y diciembre de 1995.
 
Los resultados correspondientes a la curva dosis-respuesta promedio reajustada (en un rango de menor sensibilidad) (figura 3), así como los perfiles de imprecisión acumulados (figura 4) para esta curva estándar y la empleada actualmente, mostraron un comportamiento que indicó que el ensayo pudiera ser revalidado en un rango de menor sensibilidad.
Figura 3
FIGURA 3. Curva dosis-respuesta promedio reajustada (n=4).
Figura 4
FIGURA 4. Perfiles de Imprecisión de las curvas dosis-respuestas actual y reajustada.

DISCUSIÓN

Hallamos un incremento significativo (p£ 0,05) de la impresición en la zona baja de la curva dosis-respuesta (ED-80) la cual produce una afectación en la reproducibilidad del ensayo en esta zona, hecho que ha sido descrito debido a la esterodasticidad de estas curvas de los inmunoensayos, lo cual hace que el error a lo largo de éstas no sea homogéneo.15,16

De todos los resultados obtenidos se infiere que se presentaron problemas con la precisión del ensayo cuando éste se utilizó en las condiciones de rutina del laboratorio, pero no con su exactitud.12,13

Para incrementar la precisión del microelisa es posible sugerir, en primer lugar: utilizar agua de calidad analítica tipo I "plus" [ conductividad < 1 uS/cm; resistencia = 1 megaOhms/cm; silicatos=0,05 mg/L y bacterias < 1 colonias/L.12] para preparar todas las soluciones utilizadas en el ensayo tal y como ha sido recomendado para los inmunoensayos de tipo competitivo.12-14 La presencia de contaminantes químicos y microbiológicos en el agua constituye una fuente importante de errores de tipo aleatorios que inciden sobre la precisión del ensayo, sobre todo, si éste se encuentra en la rutina diaria del laboratorio.12,13

En segundo lugar, es posible reajustar la curva dosis-respuesta (con la eliminación del primer punto de ésta y la adición de otro de mayor concentración) teniendo en cuenta que el ensayo resulta demasiado sensible para los fines diagnósticos para los cuales fue diseñado (la muestra se diluye 1:50). Se ha reportado una imprecisión importante en los primeros puntos de la curva dosis-respuesta donde la envoltura del error es superior; lo cual hace que exista una relación inversamente proporcional entre la sensibilidad y la precisión de los inmunoensayos.12-16

Cuando ensayamos una curva dosis-respuesta con un rango de menor sensibilidad, los resultados obtenidos fueron promisorios (figura 3) pues se hallaron menores coeficientes de variación de los parámetros de la curva, lo cual indicó una mejoría en la precisión del ensayo. Lo anterior, se confirmó al calcular los perfiles de imprecisión acumulados15-17 de cada curva (figura 4) donde demostramos que el ensayo comienza a tener una precisión aceptable (CV £ 10 %)13,15-17 entre los puntos 0,5-6,25 mg/mL, por lo cual la curva dosis-respuesta actual cuyo rango abarca desde 0,2-6,25 mg /mL tiene una envoltura del error muy elevada en los 3 primeros puntos, mientras que en la curva reajustada con menor sensibilidad, los puntos donde se encuentran las menores imprecisiones caen en el centro de la curva dosis-respuesta con lo cual el ensayo adquiriría robustez.

En el caso en que fuera necesario, por fines diagnósticos, que el ensayo conservara su alta sensibilidad, se sugiere el desarrollo de un ELISA tipo "sandwich" en el cual se mejoraría significativamente la precisión al eliminarse el principio de la competitividad de este ensayo.17

AGRADECIMIENTOS

El presente trabajo ha sido financiado, en parte, por el Programa de Reproducción Humana de la Organización Mundial de la Salud (HRP/WHO).

SUMMARY

This paper is aimed at evaluation how a microelisa works under optimal and routine conditions to determine microalbuminuria at the National Institute of Endocrinology. The intra and interassay variation coefficients of the high quality control, as well as the parameters of the standard curve during validation under optimal conditions coincided with what is reported for these methods. However, under routine conditions, there were low and high quality controls and randomised variations that affected assay's accuracy. To strenghten the method it is suggested to use water of analytical quality type, and to readjust the dosage-responsecurve or to develop a sandwich ELISA system.

Subject heading: ENZIME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods; ALBUMINS/analysis; QUALITY CONTROL; ALBUMINURIA/urine.

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Recibido: 10 de septiembre de 1996. Aprobado: 2 de noviembre de 1996.

Lic. Amparo Teresa Nisembaum Alas. Instituto Nacional de Endocrinología, Zapata y C, Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP. 10400.

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