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Rev Cubana Endocrinol 1998;9(1):16-28
Instituto Nacional de Endocrinología Departamento de Reproducción Humana

Aislamiento y caracterización de proteínas unidas a prolactina en el plasma de pacientes hiperprolactinémicos

Lic. Víctor Cabrera Oliva,1 Lic. Dania Martínez Nissembaum,1 Lic. Julio César Rodríguez García1 y Lic. Alina Chapé Puerta1

1 Licenciado en Bioquímica.

RESUMEN

Se analizaron los resultados de la purificación y caracterización de las proteínas que se encuentran unidas a la PRL en el plasma de pacientes hiperprolactinémicos. Se demostró la existencia del complejo proteico mediante incubación del plasma con PRL marcada con yodo radiactivo (PRL-I125), seguido por separación cromatográfica de gel filtración en Sephacryl S-300HR. Se comparó el patrón de elución con proteínas de pesos moleculares conocidos y la radiactividad incorporada se determinó por conteo de las radiaciones gamma. El complejo prolactina-proteína eluyó en un rango de pesos moleculares elevados. Se aislaron las proteínas unidas a la prolactina por cromatografía de afinidad en una columna de prolactina ovina (oPRL) unida a Sepharosa 4B activada con bromuro de cianógeno. La concentración de proteínas en 5 lotes analizados en forma sucesiva, fue de 180"74Fg/fraccionamiento. Las proteínas aisladas mostraron homología inmunológica con la IgG humana mediante el análisis por inmunodifusión radial en geles de agarosa. Según el patrón electroforético encontrado, las proteínas que se unen a la PRL en el plasma están formadas por 4 bandas de pesos moleculares, 2 de las cuales coinciden con las cadenas ligeras y pesadas de la IgG, mientras que las otras 2 presentan pesos moleculares aproximados de 68 y 80 kDa, respectivamente. Los resultados encontrados permiten identificar a las proteínas unida a la PRL como un complejo con una estructura molecular en la cual participa la IgG.

Descriptores DeCS: HIPERPROLACTINEMIA/sangre; PROLACTINA/metabolismo; PROTEINAS PORTADORAS/aislamiento & purificación; PROTEINAS SANGUINEAS/aislamiento & purificación.

La prolactina (PRL) interviene en muchas más funciones fisiológicas que todas las hormonas hipofisarias combinadas. Dentro de estas funciones se encuentran la regulación del desarrollo de las glándulas mamarias, iniciación y mantenimiento de la lactación, inmunomodulación, osmorregulación y modificaciones generales de la conducta.1 Hasta el presente no se ha podido conocer el espectro completo de sus funciones en los mamíferos.

La mayoría de los autores plantean que la multifuncionalidad de la PRL debe de estar obligatoriamente relacionada con la presencia de diferentes mecanismos de acción. Para que ocurra el tránsito intracelular de ésta se postula la existencia de procesos multietapas dentro de los cuales se incluyen la endocitosis y el transporte direccional. Estos mecanismos pudieran involucrar ya sea a la PRL sola o unida a un receptor o proteína de unión.2

Se han identificado proteínas que se unen a la PRL en la leche de conejas3,4 y de seres humanos,5 las cuales presentan un peso molecular aproximado de 33 kDa, pero los detalles de su estructura y función aún no han podido ser esclarecidos. Algunos autores6-8 han investigado las proteínas que se unen a la hormona de crecimiento (GH) en el suero de conejos y en el de seres humanos. Después de purificar y secuenciar el receptor de la GH y de clonar el cDNA del receptor, los autores logramos demostrar la identidad de la secuencia aminoacídica de las proteínas de unión de GH con el dominio extracelular del receptor de membrana de la GH. Por la gran similitud estructural y funcional de la GH con la PRL, se podría sospechar que las proteínas que se unen a esta última se corresponden con un fragmento soluble del receptor de membrana de la hormona, sin embargo, esta hipótesis no ha sido demostrada hasta el presente.

Cohen y otros9 caracterizaron las proteínas que se unen a la PRL en el suero de rata y demostraron que el complejo formado por la oPRL y el I125 se eluye en el volumen muerto después de filtrar por Sephadex G-100, lo cual sugiere la presencia de una proteína de alto peso molecular. En la electroforesis, bajo condiciones no reductoras, se encontró una banda de proteína con un peso molecular de 160 kDa, capaz de unirse a la PRL-I125, cuando se transfiere a nitrocelulosa. Bajo condiciones reductoras aparecieron 2 bandas con pesos moleculares de 50 kDa y 2 de 27 kDa, unidas entre ellas por enlaces disulfuro.

Amit y otros10 estudiaron las proteínas de unión para la PRL y la GH en el suero de diferentes mamíferos y encontraron que estas hormonas se unen al suero con distintas constantes de afinidad, lo cual depende de la hormona, de la especie estudiada y del sexo. Estos autores demostraron, utilizando un anticuerpo específico, que existe una gran similitud entre las proteínas que se unen a la GH y el receptor somatogénico en conejos.

Aunque algunos autores han demostrado que las proteínas que se unen a la PRL son muy parecidas a los fragmentos extracelulares de los receptores de membranas, otros investigadores han encontrado que la IgG del suero humano normal se une a la PRL en condiciones in vitro.11 Esta unión podría representar un mecanismo mediante el cual la hormona ejercería su función inmunomoduladora. Walker y otros12 demostraron que la PRL unida a la IgG en el suero humano no es un complejo convencional entre el anticuerpo anti-PRL y la PRL, sino un tipo de asociación diferente entre la PRL con la región Fab de la cadena pesada de la IgG. Estos autores encontraron que el complejo formado por la IgG y la PRL en el suero humano actúa como un coestimulador que causa la proliferación de una línea maligna de células de linfocitos B.

Recientemente, Hattori y otros13 confirmaron la presencia de un autoanticuerpo anti-PRL en pacientes con hiperprolactinemia idiopática y macroprolactinemia, mediante la incubación de los sueros con PRL-I125 seguido por la inmunoprecipitación con un suero de conejo anti-IgG humano. Este fenómeno existe en las enfermedades conocidas como mediadas por autoinmunidad. Las causas que llevan a la formación de autoanticuerpos en estos pacientes aún no han sido esclarecidas y en los casos donde se encontró la presencia de autoanticuerpos no hubo evidencias sugestivas de enfermedades autoinmunes.

Cavaco y otros14 demostraron que algunas formas de PRL de alto peso molecular o big-big (bbPRL), se comportan como un complejo de PRL monomérica con una inmunoglobulina G en pacientes con macroprolactinemia o prolactinoma. Estos autores encontraron que el 60 % de la bbPRL de pacientes con macroprolactinemia era retenida en una columna de agarosa, indicando que esta forma de PRL contenía IgG.

En un paciente con macroprolactinemia en el cual más del 76 % de la PRL inmunorreactiva estaba constituida por la forma bbPRL, se encontró que el 75 % de la hormona estaba unida a IgG. En otros pacientes con prolactinomas se encontró el 25 % de la PRL en forma de bbPRL unidad a IgG. Tanto en los pacientes con macroprolactinemia como en los pacientes con prolactinomas aparecía la forma monomérica de la PRL después de la inmunoprecipitación de la bbPRL. Los resultados encontrados por los autores demuestran que la bbPRL es en parte un complejo de la forma monomérica de la hormona con la IgG y no un anticuerpo, y que de esta forma

imita las acciones de la PRL. Hasta el presente, los resultados aparecidos en la literatura y que hacen referencia a las relaciones de la PRL con otras proteínas, son contradictorios y no han demostrado en forma definitiva cuál es la naturaleza de las proteínas que se unen a la PRL en el plasma de pacientes hiperprolactinémicos. No se conoce hasta el presente si la PRL para unirse a otras proteínas necesita sufrir algún cambio en su estructura como serían la glicosilación, fosforilación, polimerización de los monómeros glicosilados o si es necesario, cualquier tipo de condensación entre las moléculas de la hormona para lograr la formación de un complejo biológicamente activo.

El objetivo del presente trabajo fue el aislamiento y la caracterización de las proteínas que se unen a la prolactina en el plasma de pacientes con diferentes tipos de hiperprolactinemia.

MÉTODOS

OBTENCIÓN Y PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS DE SUERO PARA AISLAR LAS PROTEÍNAS UNIDAS A LA PRL

Para el desarrollo de la presente investigación utilizamos muestras plasmáticas de pacientes con hiperprolactinemia de diferentes orígenes. Las muestras con valores de PRL determinadas por radioinmunoensayo (RIA) superiores a 1 200 mUI/L las conservamos a -20 EC hasta su utilización.

MARCAJE DE LA PRL HUMANA

Marcamos con I,125 por el método de la lactoperoxidasa descrito por Thorell y Johansson la PRL humana utilizada como trazador en todos los experimentos.15 La actividad específica obtenida osciló entre 75 y 80 FCi/mg.

UNIÓN DE PRL A LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Descongelamos las muestras, las unimos en una sola fracción y las centrifugamos a 2 000 xg y 4 EC durante 10 min y diluimos 5 mL del plasma en una proporción 1:2 con una solución tampón de TRIS/HCL (Trishidroximetilaminometano) 25 mM, pH 7,5, que contenía 10 mM MgCl2) albúmina bovina sérica (BSA) al 0,5 % y HEPES 25 mM. A esta mezcla le añadimos 100 000 cpm de PRL-I125 y la incubamos durante 1 h a 37 EC. Después de la incubación, aplicamos la muestra a una columna de 2,6 x 100 cm de Sephacryl S-300 HR (Pharmacia, Suecia), equilibrada con un tampón PBS (fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM, bsa 0,1 %, pH 7,2). Calibramos previamente la columna con proteínas de pesos moleculares conocidos (BIORAD, EU) y la eluimos con el mismo tampón de equilibrio descrito anteriormente a un flujo constante de 15 mL/h, con una bomba peristáltica (Microperpex, Pharmacia, Suecia). Recolectamos fracciones de 6 mL en un colector automático (Frac-100, Pharmacia, Suecia). Determinamos la radiactividad incorporada en un equipo contador para radiaciones Gamma (ST-6, Nuclear interprise, Inglaterra). Para determinar las posibles interacciones inespecíficas de los componentes de la solución tampón con el trazador radiactivo. Desarrollamos en forma paralela, todo el procedimiento de cromatografía, pero sustituyendo la muestra plasmática por el mismo volumen de la solución tampón.

PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS UNIDAS A PRL. PREPARACIÓN DE LA MATRIZ DE AFINIDAD

Preparamos una columna de afinidad por acoplamiento de 20 mg de prolactina ovina (oPRL) con 1 g de Sepharosa 4B activada con bromuro de cianógeno (CnBr-Sepharosa 4B), según las instrucciones del fabricante y que consisten en el siguiente procedimiento: lavamos 1 g de Sepharosa activada y la resuspendimos en una solución de HCL 200 mM (200 mL/g). Disolvimos la oPRL en una solución tampón de acoplamiento consistente en NaHCO9 0,1 M; pH 8,3 y suplementada con NaCl 0,5 M. Adicionamos el gel a la solución de oPRL y la incubamos con agitación suave durante toda la noche a 4 EC. Bloqueamos los grupos activos remanentes en la matriz mediante incubación con una solución de glicina 0,2 M: pH 8,0 durante toda la noche a 4 EC. Eliminamos el exceso de oPRL mediante lavados con el tampón de acoplamiento. Finalmente sometimos la columna a un ciclo de 3 lavados en forma alternativa con un tampón de acetato de sodio (0,1 M; pH 4,0) que contenía NaCl 0,5 M, seguido por el tampón de acoplamiento. Conservamos la columna de afinidad equilibrada con el tampón de acoplamiento a 4 EC.

PURIFICACIÓN DE LAS PROTEÍNAS UNIDAS A PRL

Diluimos 15 mL de plasma en una proporción 1:2 con PBS que contenía 2 mM fenilmetanosulfonilfluoruro (PMSF). Centrifugamos la dilución a 3 000 x g y 4 EC durante 30 min y la filtramos a través de una membrana "Millipore" de 0,22 mm. Recirculamos la muestra durante 48 h por la matriz de afinidad en un circuito cerrado, a un flujo de 10 mL/h y la lavamos en forma sucesiva con 10 mL de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5; 15 mL de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 que contenía 150 mM de NaCl; 10 mL de Tritón X-100 al 1 % en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5 y finalmente, con 10 mL de Tris-HCl 25 mM, pH 7,5. Eluimos las proteínas unidas con MgCl2 5 M en Tris-HCl 25 mM, pH 7,5. Las fracciones de 1 mL con DO 280 mayores de 0,04 las reunimos y las dializamos durante toda la noche contra 5 L de Tris-HCl 10 mM, pH 7,4. Concentramos el volumen dializado hasta 1 mL y determinamos el contenido total de proteínas de acuerdo con el método de Lowry,16 utilizando BSA como patrón de referencia.

DETERMINACIÓN DE LA HOMOLOGÍA INMUNOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS UNIDAS A PRL

Determinamos la homología inmunológica de las proteínas unidas a la prolactina mediante su enfrentamiento a un anticuerpo anticadenas pesadas de la IgG humana y un suero total anti-IgG humana. Desarrollamos la reacción en geles de agarosa al 1 % de acuerdo con los métodos de rutina del laboratorio.

CARACTERIZACIÓN ELECTROFORÉTICA DE LAS PROTEÍNAS UNIDAS A PRL EN EL PLASMA HUMANO

Las muestras de proteínas unidas a prolactina en el plasma humano las sometimos a electroforesis en geles de acrilamida al 12,5 % en presencia de sodiodecilsulfato (SDS) al 10 % y bajo condiciones reductoras de acuerdo con el método descrito por Laemmli.17 Teñimos los geles con azul de coomasie y analizamos los patrones electroforéticos obtenidos mediante densitometría láser. Los pesos moleculares para las bandas de proteínas obtenidas los determinamos por comparación contra marcadores de pesos moleculares (Low Molecular Weight Markers, Pharmacia, Suecia) corridos bajo las mismas condiciones.

RESULTADOS MARCAJE DE PRL HUMANA CON I125

En la figura 1 se muestra el perfil de elución del marcaje de la prolactina humana utilizada en los experimentos desarrollados. El perfil está compuesto por 3 picos de radiactividad, que corresponden a la hormona agregada, hormona monomérica monoyodada con una actividad específica entre 75 y 80 mCi/mg y al yodo radiactivo no incorporado a proteínas, respectivamente. Este perfil concuerda con los resultados  históricamente obtenidos por este laboratorio en el marcaje de hormonas peptídicas.
Figura 1
FIG. 1. Separación cromatográfica de la PRL humana marcada con I125 por el método enzimático. Pico 1: agre-gados de alto peso molecular. Pico 2: hormona monomérica monoyodada. Pico 3: exceso de yodo libre.

ESTUDIO DE LA UNIÓN DE PRL-I125 A PROTEÍNAS PLASMÁTICAS

Cuando incubamos el plasma de pacientes hiperprolactinémicos con PRL-I125 y sometimos el producto a separación por cromatografía en filtración por gel, detectamos 3 picos con radiactividad incorporada (fig. 2). De acuerdo con la curva de calibración para la columna de fraccionamiento que realizamos bajo las mismas condiciones experimentales y utilizando proteínas de pesos moleculares conocidos (fig. 3), los pesos moleculares aproximados de los picos obtenidos fueron 160-180 kDa, 30-40 kDa y 24-27 kDa, respectivamente.

El primer pico radiactivo no aparece en la cromatografía control, lo cual indica que el mismo pertenece al complejo formado por la unión específica entre las proteínas plasmáticas y la PRL-I125. Los picos 2 y 3 con radiactividad incorporada aparecen tanto en el plasma como en la cromatografía control y de acuerdo con sus pesos moleculares aproximados calculados deben corresponder a una pequeña cantidad de agregados moleculares de la hormona utilizada como trazador y a la forma monomérica, respectivamente.

Figura 2
FIG. 2. Perfil cromatográfico de filtración por gel de las proteínas plasmáticas unidas a PRl-I125. Pico 1: complejo de alto peso molecular. Pico 2: agregados de hormona monoyodada. Pico 3: exceso de la hormona monomérica yodada utilizada como trazador radiactivo.
figura 3

FIG. 3. Curva de calibración de la columna de gel filtración con proteínas de pesos moleculares conocidos (tiroglobulina, 660 k; g-globulina 160 k; albúmina de huevo, 43 k; mioglobina, 14,4 k; cianocobalamina, 3k.

CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD DE LAS PROTEÍNAS UNIDAS A PRL EN EL PLASMA

En la figura 4 se muestra el pico de elución de las proteínas unidas a la prolactina y que se separaron en forma específica, mediante cromatografía de afinidad a partir del plasma de pacientes hiperprolactinémicos. Este perfil fue consistente y reproducible en más de 5 fraccionamientos realizados.

El contenido total promedio de proteínas después de concentrar el pico eluído hasta 1 mL, fue de 180 " 74 mg/ /fraccionamiento.

Figura 4
FIG. 4. Perfil de la cromatografía de afinidad para la purificación de las proteínas unidas a PRL.

HOMOLOGÍA INMUNOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS UNIDAS A PRL

Determinamos la homología inmunológica de las proteínas unidas a PRL mediante enfrentamiento de las proteínas purificadas por cromatografía de afinidad, contra un antisuero purificado dirigido contra las cadenas pesadas de la IgG humana, así como un suero total anti-IgG humana. En la figura 5 aparece la placa de inmunodifusión en agarosa al 1 % de las distintas variantes de enfrentamientos ensayadas.

Figura 5
FIG. 5. Determinación de la homología inmunológica de las proteínas unidas a PRL por inmunodifusión radial. Proteínas unidas a PRL Contra: Rosa 1, antisuero contra las cadenas pesadas de la IgG; Rosa 2, suero total anti-IgG humana; Rosa 3, contra suero humano normal; Rosa 4, contra los distintos tampones utilizados en el proceso de purificación.

En la primera rosa, aparecen las proteínas unidas a PRL enfrentadas a diluciones sucesivas 1:2 del antisuero purificado dirigido contra las cadenas pesadas de la IgG humana. Se pueden observar líneas de precipitación muy bien definidas prácticamente en todas las diluciones del anticuerpo utilizadas.

En la segunda rosa, las proteínas unidas a PRL se enfrentaron a diluciones sucesivas de un suero dirigido contra las IgG humanas totales. Las líneas de precipitación se hicieron evidentes en la mayoría de las concentraciones de anticuerpo utilizadas.

En la tercera rosa, las proteínas unidas a PRL se enfrentaron a un suero humano normal y no se observaron líneas de precipitación.

En la cuarta rosa, se presenta el resultado de un control, en el cual se enfrentaron las proteínas unidas a PRL con las diferentes soluciones tampones utilizadas durante el proceso de purificación. No hubo ninguna línea de precipitación.

CARACTERIZACIÓN ELECTROFORÉTICA EN CONDICIONES REDUCTORAS DE LAS PROTEÍNAS PLASMÁTICAS UNIDAS A PRL

En la figura 6 se muestran los electroforegramas obtenidos por densitometría láser de las distintas bandas de proteínas y que se produjeron por electroforesis bajo condiciones reductoras.

Comparamos los pesos moleculares de todas las bandas de proteínas correspondientes a las muestras y a los controles analizados, contra el patrón obtenido a partir de proteínas de pesos moleculares conocidos y analizados bajo las mismas condiciones experimentales (fig. 6E).

El análisis de la prolactina ovina (oPRL) utilizada como control (fig. 6A), presentó 2 bandas con tiempos de retención de 0,81 y 1,59 min, respectivamente. La primera banda, con un peso molecular aproximado de 40 kDa se corresponde, probablemente, con agregados moleculares que no se rompen bajo las condiciones reductoras utilizadas, mientras que la segunda banda representa a la forma monomérica de la hormona, con un peso molecular aproximado de 24 kDa.

Según los resultados que aparecen en la figura 6D, el patrón electroforético de las proteínas unidas a la PRL analizadas bajo condiciones reductoras, está compuesto por 4 bandas bien definidas, con pesos moleculares aproximados de 80, 60, 50 y 25 kDa. Cuando comparamos este patrón con el de la IgG humana purificada (fig. 6C), observamos que en ambos casos las bandas de pesos moleculares de 50 y 25 kDa coincidían exactamente. Estas bandas concuerdan, a su vez, con la estructura de las bandas de proteínas mayoritarias del plasma humano (fig. 6B).
Figura 6
FIG. 6. Electroforegrama por densitometría láser de las proteínas unidas a PRL y controles analizados por electroforesis en condiciones reductoras.

CÁLCULO DE LOS PESOS MOLECULARES APROXIMADOS DE LAS BANDAS DE PROTEÍNAS SEPARADAS POR ELECTROFORESIS BAJO CONDICIONES REDUCTORAS

Para calcular los pesos moleculares utilizamos la curva que se muestra en la figura 7, construída con patrones de bajo peso molecular de la siguiente composición: lactoalbúmina 14 400; inhibidor de tripsina 20 000; anhidrasa carbónica 30 000; albúmina de huevo 43 000; albúmina bovina sérica 67 000 y fosforilasa B 94 000 Dalton.

Figura 7
FIG. 7. Curva de calibración para determinar pesos moleculares en condiciones reductoras.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos en el presente estudio muestran claramente que en el plasma de pacientes hiperprolactinémicos existen proteínas que circulan unidas a la PRL. Cuando estas proteínas se separaron por cromatografía de gel filtración, eluyeron en un volumen que indica que este complejo tiene un peso molecular ligeramente superior al de la IgG.

De acuerdo con los reportes de Geffner y otros,18 en el líquido amniótico existe la variante glicosilada de la prolactina (gPRL), la cual se encuentra fuertemente unida a la inmunoglobulina y sugieren la posibilidad de que en el suero humano suceda un fenómeno similar. Según los resultados de los mismos autores, está claro que al menos una o más subclases de la IgG se unen a la gPRL, pero que además, es muy posible, la unión de gPRL a la IgA.

Las funciones potenciales del complejo formado por la gPRL y la IgG son numerosos. Las inmunoglobulinas pueden evitar que la gPRL sea eliminada de la circulación lo cual prolongaría la vida media de la hormona. Las inmunoglobulinas podrían actuar como transportadores de la gPRL para llevar a la hormona a compartimentos a los cuales por sí sola, ella no podría llegar. Es posible además que la gPRL unida a la IgG pueda bloquear sitios de reconocimiento en la IgG y de esta forma modificar sus funciones.

Walker y otros,12 opinan que el hallazgo de que la PRL pueda circular en el suero humano en forma de un complejo con la IgG, podría ser un buen motivo para considerar la posibilidad de que este complejo tenga, quizás, una función inmunomoduladora muy importante. Los mismos autores demostraron que este complejo tiene una actividad proliferativa marcada sobre una línea de células T malignas las cuales sólo contienen el receptor para la prolactina (Nb2), en los linfocitos de la sangre de seres humanos normales que contienen los receptores para la PRL y para la región Fc y en los linfocitos de sangre de pacientes con leucemia crónica linfocitaria de células tipo B, los cuales también expresan ambos tipos de receptores, pero que representan a una población de células B menos maduras.

Con la metodología utilizada en la presente investigación para el aislamiento de las proteínas que se unen a la PRL en el suero de pacientes hiperprolactinémicos y que se basa en el uso de una columna de afinidad, obtuvimos estas proteínas en un estado de pureza que permitió el estudio de su composición mediante una técnica tan sensible como es la electroforesis en condiciones reductoras. La utilización de prolactina ovina (oPRL) en la preparación de la columna de afinidad para aislar proteínas de origen humano fue posible porque estas hormonas tienen un alto grado de homología (87 %) entre ambas especies. La oPRL por su relativa abundancia y menor costo, se utiliza en los estudios relacionados con los receptores y radioligandos.

Cohen y otros,9 caracterizaron las proteínas que se unen a la PRL en el suero de rata. En electroforesis, bajo condiciones nativas, estos autores encontraron que la proteína tenía un peso molecular de 160 kDa y que después de su reducción aparecían 2 bandas con pesos moleculares de 50 y 27 kDa respectivamente. Cuando esta proteína era transferida a nitrocelulosa, sólo la fracción de 50 kDa se unía a la PRL.

La presente investigación se basó en el estudio de las proteínas que se unen a la PRL en el plasma de pacientes hiperprolactinémicos. Encontramos que estas proteínas están representadas por 4 sub-unidades, 2 de las cuales tienen el mismo peso molecular que las 2 fracciones que se producen cuando se trata la molécula de IgG humana en condiciones reductoras. La presencia de 2 bandas adicionales diferentes a las de la IgG en la estructura de las proteínas que se unen a la PRL, las cuales tienen pesos moleculares aproximados de 80 y 60 kDa, son un indicio de que se trata de una molécula mucho más compleja que la IgG, por lo cual es posible que las mismas tengan propiedades tanto de IgG como de receptor soluble.

Este hecho podría explicar, en parte, los reportes contradictorios que han aparecido en la literatura relacionados con la identificación de la estructura de las proteínas que se unen a la PRL.

Si bien los resultados encontrados durante el desarrollo de la presente investigación demuestran claramente que por la naturaleza inmunológica de las proteínas que se unen a la PRL las mismas corresponden a la IgG, no niegan la posibilidad de que a la vez tengan las propiedades inherentes a un receptor como han comprobado algunos autores.8

Los resultados demuestran que es imprescindible demostrar la doble funcionalidad de estas proteínas y desarrollar un sistema analítico que permita determinar cuál es su función fisiológica, tanto en las hiperprolactinemias como en las enfermedades de tipo autoinmune.

SUMMARY

The results of the purification and characterization of prolactin binding proteins in plasma of hyperprolactinemic patients were analyzed. The existance of the protein complex was proved by incubation of plasma with prolactin marked with radioactive iodine (PRL-I125) followed by chromatographic separation of filtration gel in Sephacryl S-300 HR. The elution pattern was compared with proteins of known molecular weight, and the incorporated radioactivity was determined by counting gamma radiations. The prolactin-protein complex eluted in a range of high molecular weights. Prolactin binding proteins were isolated by affinity chromatography in a column of ovine prolactin (oPRL) bound to Sepharose 4B activated with cyanogen bromide (CNBr-Sepharose 4B). The concentration of proteins in 5 lots analyzed in a row was of 180 " 74 mg/fractionation. The isolated proteins showed immunological homology with human IgG by the radial immunodifussion analysis in agarose gel. According to the electrophoretic pattern found, PRL binding proteins in plasma consist of 4 bands of molecular weights, 2 of which coincide with the light and heavy chains of IgG, where as the other 2 have molecular weights of approximately 68 and 80 KDa, respectively. The results obtained allow to identify PRL binding proteins as a complex with a molecular structure, in which IgG is included.

Subject headings: HYPERPROLACTINEMIA/blood; PROLACTIN/metabolism; CARRIER PROTEINS/isolation & purifications; BLOOD PROTEINS/isolation & purification.

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Recibido: 14 de octubre de 1997. Aprobado: 2 de diciembre de 1997.

Lic. Víctor Cabrera Oliva. Instituto Nacional de Endocrinología, Departamento de Reproducción Humana, Zapata y C, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba.

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