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Rev Cubana Endocrinol 1998;9(1):53-55

Técnicas

Instituto Nacional de Endocrinología Departamento de Diabetes Grupo de Metodología Diagnóstica

Metodología preparativa y analítica para estandarizar y validar un sistema Elisa para cuantificar IgG de ratón

Lic. Eulises Díaz Díaz,1 Lic. María Celeste Arranz Calzado,2 Dra. Martha Deás Rodríguez3 y Dr. Roberto M. González Suárez4
  1. Licenciado en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
  2. Licenciada en Bioquímica. Investigadora Agregada.
  3. Especialista de II Grado en Bioquímica.
  4. Doctor en Ciencias. Investigador Titular.

RESUMEN

Se purificó IgG de ratón por precipitación salina, seguido de una cromatografía de intercambio iónico, con el objetivo de desarrollar un método analítico que permitiera cuantificar anticuerpos monoclonales de origen murino. El producto fue utilizado para producir un anticuerpo policlonal en carnero. Se siguió un esquema de inmunización de varios meses con la utilización de adyuvantes, completo e incompleto, de Freund para lograr anticuerpos de alta afinidad. Se purificaron los lotes de antisueros seleccionados por cromatografía de inmunoafinidad mediante una matriz de IgG de ratón-Sepharose CL-4B. Los anticuerpos anti-IgG de ratón purificados fueron conjugados con peroxidasa de rábano picante y además, utilizados como recubrimiento. Se estandarizó un método ELISA tipo sandwich que barre un rango dinámico de 31,25-500 ng/mL. Se estudió la exactitud mediante la evaluación de la linealidad, el paralelismo y la comparación con un método de referencia y la precisión, según la repetibilidad y la reproducibilidad. Se concluyó que el sistema estandarizado cumple con los requisitos analíticos para cuantificar IgG de ratón.

Descriptores DeCS: TEST DE ELISA/normas; TEST DE ELISA/métodos; IGG/aná-lisis; RATONES.

Los anticuerpos monoclonales (AcM) son ampliamente utilizados en el diagnóstico clínico por su capacidad de interaccionar específicamente con un determinado analito que forma parte de una mezcla compleja, como son los fluidos biológicos. Estas biomoléculas producidas por métodos biotecnológicos constituyen el reactivo más importante y costoso en los sistemas de diagnóstico, de ahí la necesidad de contar con un conjunto de procedimientos y técnicas analíticas que permitan un adecuado control del proceso de su producción. En este trabajo se describe la metodología seguida para producir los reactivos primarios, la estandarización y validación de un sistema ELISA tipo sandwich para cuantificar IgG de ratón, el cual resulta de gran utilidad para el monitoreo del proceso de producción de los AcM.

MÉTODOS

PURIFICACIÓN DE IgG DE RATÓN

Utilizamos un método basado en la precipitación salina, seguida por una cromatografía de intercambio iónico.1 Precipitamos 10 mL de suero normal de ratón con sulfato de amonio (MERCK) a una concentración final de 50 % y posteriormente, lo dializamos toda la noche contra tampón fosfato de sodio (MERCK) 17,5 mM pH 6,5 para luego aplicarlo en una columna de DEAE-celulosa (Whatman), previamente equilibrada con el mismo tampón, a un flujo de 30 mL/h y recogimos fracciones de 3 mL/tubo. Monitoreamos por DO a 280 nm y dializamos el pico que salió de la columna, contra tampón PBS pH 7,2 y le determinamos la concentración de proteínas por el método de Lowry,2 el resto de las proteínas del suero que interaccionan con la matriz fueron eluídas con tampón fosfato de sodio 200 mM pH 6,5. La IgG purificada la utilizamos como inmunógeno para producir el anticuerpo policlonal específico. Evaluamos por inmunoelectroforesis el grado de pureza de la IgG purificada.

PRODUCCIÓN DE LOS ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI-IgG DE RATÓN

Inmunizamos, varias veces, carneros adultos jóvenes, la primera con 150 mg de IgG de ratón mezclados con adyuvante completo de Freund, esperamos 15 d y reestimulamos con 70 mg de IgG de ratón mezclados esta vez con adyuvante incompleto de Freund, las dosis sucesivas tuvieron intervalos de 1 mes entre una y otra, utilizamos una dosis fija de 70 mg en adyuvante incompleto durante 8 meses sucesivos. Extrajimos sangre 15 d después de cada inmunización para testar el título de anticuerpos por inmunodifusión doble.3 Los lotes con calidad adecuada, una vez purificados por inmunoafinidad sobre una matriz de IgG de ratón-Sepharose CL-4B, los utilizamos para conjugar con la peroxidasa de rábano picante (Tipo VI, Rz = 3,1, Sigma) y como anticuerpos de recubrimiento.

PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS ANTI-IgG DE RATÓN

Utilizamos una matriz de IgG-Sepharose CL-4B de ratón previamente preparada en nuestro laboratorio, según procedimiento de la Pharmacia.4 Aplicamos 8 mL de una dilución 1:2 en PBS pH 7,2 del suero hiperinmune anti-IgG de ratón a una columna C 10/10 (Pharmacia) a un flujo de 35 mL/h. La lavamos con PBS pH 7,2 y eluímos los anticuerpos específicos unidos a la matriz con tampón 100 mM glicina (MERCK) pH 3, colectamos fracciones de 2mL en tubos que contenían 60 mL de tampón 1 M Tris (MERCK) pH 8,9 para neutralizar el pH extremadamente ácido necesario para la elución. Posteriormente, dializamos contra PBS.5 Evaluamos por inmunoelectro-foresis la actividad biológica y el grado de pureza de los anticuerpos policlonales purificados.

OBTENCIÓN DEL CONJUGADO ANTI-IgG DE RATÓN-PEROXIDASA

Sintetizamos el conjugado por el método del peryodato de sodio.6 Para ello, conjugamos 2,5 mg anti-IgG de ratón purificado por inmunoafinidad con 2,5 mg de peroxidasa de rábano picante (tipo VI, Rz = 3,1, Sigma).

Resuspendimos 2,5 mg de peroxidasa de rábano picante en 1,2 mL de agua bidestilada y le adicionamos 0,3 mL de peryodato de sodio (MERCK) 0,1 M en 10 mM de fosfato de sodio (MERCK) pH 7, preparado recientemente. Incubamos la solución 20 min a temperatura ambiente (TA) con agitación magnética, posteriormente la dializamos contra tampón acetato de sodio (AnalaR) 1 mM pH 4 a 4 EC durante toda la noche. Dializamos, simultáneamente, contra tampón carbonato de sodio (AnalaR) 200 mM pH 9,5 a 4 EC, 500 mL de la solución que contenía 2,5 mg de anticuerpos anti-IgG de ratón. Posteriormente, mezclamos ambas soluciones 2 h a T A con agitación magnética y le adicionamos 100 mL de borohidruro de sodio (MERCK) 4 mg/mL en agua bidestilada para estabilizar las bases de Schiff y la incubamos 2 h a TA con agitación magnética. Finalmente, la dializamos contra PBS pH 7,2 a 4 EC durante toda la noche, la mezclamos con glicerol (Fluka) y la guardamos a -20 EC.

DESCRIPCIÓN DEL ENSAYO

Estandarizamos un sistema ELISA tipo sandwish, para lo cual recubrimos placas de cloruro de polivinilo (PVC) con 10 mg/mL de anti-IgG de ratón en tampón carbonato de sodio (AnalaR) 50 mM pH 9,6 y los incubamos durante 16 h a 4 EC en cámara húmeda. Lavamos las placas 3 veces con PBS-Tween (Tween 20, Sigma) 0,05 %, les adicionamos 100 mL de la muestra y las incubamos 1 h a 37 EC en cámara húmeda. Posteriormente, las lavamos con tampón de lavado 3 veces y les añadimos 100 FL de una dilución 1:25 000 del conjugado anti-IgG-peroxidasa, las incubamos durante 1 h a 37 EC en cámara húmeda. Las lavamos 3 veces y revelamos la reacción añadiendo 100 FL de una solución del sustrato de la peroxidasa ortofenilediamina más pe-róxido de hidrógeno (NEN TECH LTD). La incubamos 30 min a TA para que tuviera lugar la transformación del sustrato por la enzima del conjugado que se había unido a la IgG capturada por el anticuerpo de recubrimiento, la intensidad del color del producto formado es proporcional a la concentración de la IgG a testar, finalmente, detuvimos la reacción adicionando 20 FL de ácido sulfúrico (AnalaR) 2,5 N y leímos la densidad óptica (DO) en un equipo SUMA a 492 nm.7-9

DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD ESTUDIO DE LINEALIDAD

Determinamos la exactitud según el estudio de linealidad, para ello ensayamos una curva estándar desde 10 - 1 000 ng/mL y establecimos el rango de concentraciones en el cual se comportaba linealmente y, por tanto, existía una relación proporcional entre la concentración del analito y la señal medida.

Ensayamos 2 curvas estándares de IgG, una del isotipo IgG1 y otra del IgG2a por ser los de los anticuerpos monoclonales desarrollados y utilizados en nuestra institución.

Preparamos las curvas estándares a partir de soluciones de AcM (suministra-do por el Centro de Inmunología Mole-cular de Cuba) purificados por Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia) y evaluamos su pureza por FPLC, electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS, focalización isoeléctrica y relación IgG/Proteína, la cual era > 99,6 %. Corregimos la concentración de las curvas estándares con el sistema de ELISA del Centro de Inmunología Molecular.

ESTUDIO DE PARALELISMO

Estudiamos también el paralelismo para demostrar la no existencia de interferencia con la determinación específica de la IgG de ratón. Para ello comparamos la pendiente y el intercepto de las curvas estándares en el rango lineal con los parámetros obtenidos de ensayar diluciones seriadas a muestras de líquido ascético murino desde 1:10 000, 1:20 000, 1:40 000, 1:80 000, 1:160 000 de AcM de los isotipos IgG1 y IgG2a que tenían una concentración de 5 mg/mL.

ESTUDIO DE COMPARACIÓN CON UN MÉTODO DE REFERENCIA

Utilizamos, como método de referencia, el sistema ELISA empleado en el Centro de Inmunología Molecular para cuantificar AcM. Determinamos la concentración de 70 muestras de AcM purificados del isotipo IgG1 y 70 del IgG2a que cubrían el rango de concentración de la curva estándar por ambos métodos y comparamos los resultados mediante un análisis de regresión lineal para determinar la exactitud del método.

DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN

Ensayamos 3 patrones correspondientes a valores bajos, medios y altos de cada uno de los isotipos de IgG de ratón de interés. Determinamos la precisión intraensayo con 10 réplicas de cada uno de los 3 patrones y la precisión interensayo, en 10 ensayos independientes con 10 réplicas por ensayo de cada uno de los 3 patrones.

RESULTADOS

PURIFICACIÓN DE IgG DE RATÓN

En la figura 1 mostramos el perfil cromatográfico correspondiente a la purificación de IgG a partir de suero normal de ratón. La concentración de IgG determinada por Lowry fue de 14 mg/mL disponiendo entonces de 70 mg de IgG de ratón en 5 mL. Se observa el primer pico que eluye con tampón fosfato de sodio 17,5 mM pH 6,5 correspondiente a la fracción de IgG que a ese pH se encuentra cargada positivamente, pues aún no se ha rebasado el valor de su punto isoeléctrico, por tanto, no interacciona con la matriz que está también cargada positivamente, el segundo pico es el resto de las proteínas del suero que por sus características ácidas se encontraban cargadas negativamente a pH 6,5 ya que este pH está por encima de su punto isoeléctrico y, por tanto, interactuaron con la matriz positiva, por lo que fue requerido aumentar la fuerza iónica para desestabilizar las interacciones electrostáticas y permitir su elución.

Figura 1
FIG. 1. Perfil cromatográfico de la purificación de IgG a partir de suero normal de ratón en DEAE-celulosa.

El producto del primer pico, al ser analizado por inmunoelectroforesis frente a un suero antitotal de ratón, mostró una única banda de precipitación cercana al punto de aplicación, característica de las gammaglobulinas, familia de proteínas a las cuales las IgG pertenecen, por ello se pudo concluir que el producto tenía un grado de pureza adecuado.

PRODUCCIÓN DE LOS ANTICUERPOS POLICLONALES ANTI-IgG DE RATÓN

Producto del esquema de inmunización seguido obtuvimos varios lotes de antisueros que al ser testados por inmunodifusión doble enfrentándolos en dilución 1:2 seriadas a una solución de 1 mg/mL de IgG de ratón dieron títulos mayores a 1:64, característica que muestra la cantidad relativa de anticuerpos específicos en el suero hiperinmune.

PURIFICACIÓN DE LOS ANTICUERPOS ESPECÍFICOS ANTI-IgG DE RATÓN

En la figura 2 mostramos el perfil cromatográfico de la purificación de los anticuerpos anti-IgG de ratón por inmunoafinidad, el primer pico corresponde a las proteínas del suero que no tienen especificidad inmunológica por la IgG de ratón inmovilizada en la matriz de Sepharose CL-4B (Pharmacia). El segundo pico de proteínas corresponde a los anticuerpos anti-IgG de ratón que habían interaccionado específicamente y que al disminuir el pH se desestabilizaban las interacciones electrostáticas que garantizaban la unión antígeno-anticuerpo al variar el grado de ionización de los grupos involucrados. La concentración de anti-IgG de ratón determinada por Lowry fue de 5 mg/mL por lo que se dispone de 12,5 mg totales. Evaluamos la pureza y la actividad inmunológica del producto por inmunoelectroforesis, al enfrentar los anticuerpos purificados con un suero normal de ratón y comprobar que sólo hubo precipitación en la región de las gammaglobulinas.

Figura 2
FIG. 2. Perfil cromatográfico de la purificación de los anticuerpos anti-IgG de ratón a partir de suero hiperinmune de carnero en IgG-Sepharose CL-4B.
OBTENCIÓN DEL CONJUGADO ANTI-IgG DE RATÓN-PEROXIDASA

Producto del procedimiento descrito en Métodos se pudo producir un conjugado de alta calidad y especificidad, el cual tuvo un título de trabajo de 1:25 000 por lo que se pudo contar con la cantidad necesaria para estandarizar, validar y prestar un servicio durante un período largo con la calidad requerida.

DETERMINACIÓN DE LA EXACTITUD

Demostramos estadísticamente que el sistema era lineal en el rango de concentraciones de 31,25-500 ng/mL para ambos isotipos de AcM, el resultado aparece en la figura 3, donde además se puede observar la diferencia de sensibilidad que posee el sistema para determinar los diferentes isotipos estudiados, esto es un fenómeno típico cuando se utilizan anticuerpos policlonales para cuantificar inmunoglobulinas

Figura 3
FIG. 3. Comportamiento lineal de los isotipos estudiados en el rango dinámico del ensayo.

Todos los datos posteriormente representados son los obtenidos de la determinación de los AcM del isotipo IgG2a, el comportamiento es similar para el caso del isotipo IgG1.

El estudio de paralelismo demostró que no existían interferencias en la determinación, pues, el anticuerpo producido reconoce de igual forma a la IgG de ratón cuando está pura en forma estándar y cuando está formando parte de una mezcla compleja, como es el caso del líquido ascítico murino. En la figura 4 se puede ver que la pendiente y el intercepto de ambos ensayos son similares.

Figura 4
FIG. 4. Estudio de linealidad y paralelismo del ensayo.
a) Comportamiento al ensayar una curva estándar.
b) Comportamiento al ensayar diluciones seriadas de un líquido ascítico murino.

No encontramos diferencias estadísticamente significativas en estos parámetros al realizar un test de comparación de las ecuaciones de regresión lineal de ambos ensayos por lo cual podemos afirmar que existe un adecuado paralelismo entre ellos, lo que reafirma estadísticamente la no interferencia de otras moléculas en la determinación específica de la IgG de ratón.

La comparación con el método de referencia demostró que el sistema desarrollado era capaz de cuantificar correctamente la concentración de IgG de ratón, lo cual mostramos en la figura 5, donde se observa que el coeficiente de correlación r2 = 0,979, indica una elevada asociación entre los valores cuantificados por el método desarrollado y por el de referencia a lo largo de todo el rango de concentraciones de la curva estándar. El valor de la pendiente m = 0,961 indica que esta asociación es directamente proporcional, luego el valor determinado por el método desarrollado coincide estadísticamente con el del método de referencia, pudimos concluir que el método desarrollado posee una adecuada exactitud.

DETERMINACIÓN DE LA PRECISIÓN

En la tabla se puede observar que la precisión intraensayo medida como el coeficiente de variación (CV) es menor del 10 % y la precisión interensayo menor del 15 %, lo cual demuestra que el sistema cumplió con los requisitos de precisión aceptados para este tipo de método analítico.

Figura 5
FIG. 5. Estudio de regresión de los valores de concentración determinados por el método desarrollado y los determinados por el método de referencia.
TABLA. Estudio de precisión del método de ELISA para la cuantificación IgG de ratón
   
Precisión intraensayo
Precisión interensayo
   
Control alto
Control medio
Control bajo
Control alto
Control medio
Control bajo
 
n
10
10
10
10
10
10
 
_ (ng/mL)
430,12
227,04
69,14
441,35
224,02
66,16
 
DE
27,11
12,34
3,33
53,26
24,41
6,11
 
CV (%)
6,30
5,43
4,82
12,06
10,90
9,24
Pudimos concluir que el sistema desarrollado cumplió con las características analíticas requeridas para su utilización con un alto grado de seguridad y confiabilidad en el valor determinado por él, por lo que puede ser utilizado para cuantificar los AcM de origen murino.

DISCUSIÓN

La metodología seguida para purificar IgG a partir de suero de ratón garantizó su utilización para producir anticuerpos específicos, los cuales fueron purificados, conjugados y utilizados además como recubrimiento. Estos reactivos primarios, por su calidad, permitieron su utilización en la estandarización y validación del sistema ELISA de doble anticuerpo sandwich, el cual cumple con los criterios analíticos necesarios para este tipo de método.

Según los resultados demostramos la adecuada exactitud y precisión para cuantificar IgG de ratón, por lo que el sistema desarrollado resulta de utilidad para cuantificar anticuerpos monoclonales murinos de tipo IgG y puede ser utilizado en el control de la calidad de su producción, al permitir seleccionar los clones más productores, evaluar la concentración de IgG de los líquidos ascíticos y de los sobrenadantes de cultivo, así como establecer los parámetros de pureza y recuperación de los procesos de purificación que son requeridos para obtenerlos con la calidad adecuada, para ser utilizados en el diagnóstico clínico.

SUMMARY

Mouse's IgG was purified by saline precipitation, followed by an ion exchange chromatography, aimed at developing and analytical method that allow to quantify monoclonal antibodies of murine origin. The product was used to produce a polyclonal antibody in lamb. An immunization scheme was followed for some months with the use of complete and incomplete adjuvants of Freund to obtain high affinity antibodies. The lots of antisera selected by immuno-affinity chromatography by using a Sepha-rose CL-4B matrix with mouse's IgG as a ligand were purified. The anti-IgG antibodies of mouse purified were conjugated with peroxidase of horse-radish, and they were also used as coating. A sandwich ELISA method scanning a dynamic range of 31.25-500 ng/mL was standardized. Accuracy was studied by the evaluation of lineality, parallelism, and the comparison with a reference method and precision, according to repetitiveness and reproducibility. It was concluded that the standardized system fulfils the analytical requirements to quantify mouse's IgG.

Subject headings: ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/standards; ENZYME-LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY/methods; IGG/analysis; MICE.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 14 de octubre de 1997. Aprobado: 27 de noviembre de 1997.

Lic. Eulises Díaz Díaz. Instituto Nacional de Endocrinología, Departamento de Diabetes, Zapata y C, El Vedado, Ciudad de La Habana, Cuba. CP 10400.

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