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Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 1997;12(1)

Técnicas

Instituto de Hematología e Inmunología. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras" Ciudad de La Habana, Cuba

Determinación de autoanticuerpos anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm y anti-U1RNP por el método de contrainmunoelectroforesis

Dra. Elena Kokuina, Dr. José E. Montero Casimiro y Lic. María C. Noyola Ugalde

RESUMEN

La caracterización de los anticuerpos antinucleares (AAN) resulta esencial para el diagnóstico de las enfermedades autoinmunes reumáticas. Los anticuerpos (ac) anti/Ro/SS-A, anti-Ls/SS-B, anti-SM y anti-U1RNP se determinaron en pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y síndrome de Sjögren primario (SS) por el método de contrainmunoelectroforesis (CTE) con la utilización de los extractos obtenidos de bazo humano y timo de conejo. En el LES las frecuencias de los ac anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm y anti-U1RNP fueron de 39,3 %, 14,3 %, 17,9 % y 32,1 %, respectivamente. En el SS las frecuencias de los ac anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B fueron 50 % y 25 %, respectivamente, y no se encontraron ac anti-Sm ni anti-U1RNP. Se encontraron ac anti-Ro/SS-A en el 50 % de las muestras de LES y en el 37,5 % de las de SS negativas para AAN en la prueba de inmunofluorescencia indirecta. Se encontró p < 0,001 entre la presencia de ac anti-U1RNP y el patrón granular de fluorescencia de los AAN, aunque éste no fue indicativo de anti-U1RNP en todos los casos. Estos resultados destacan el valor diagnóstico de la CIE para el LES y el SS y respaldan su aplicación en la práctica clínica.

Palabras clave: LUPUS ERITEMATOSO SISTEMICO/diagnóstico; SINDROME DE SJÖGREN/diagnóstico; CONTRAINMUNOELECTROFORESIS; ANTICUERPOS ANTINUCLEARES/uso diagnóstico.

INTRODUCCION

Hasta el momento se han caracterizado 4 clases fundamentales de autoanticuerpos frente a las moléculas de ribonucleoproteínas (RNPs) que comprenden los anticuerpos (ac) anti-U1RNP, anti-Sm, anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B.1 La presencia de los acs anti-Sm constituye un criterio diagnóstico del lupus eritematoso sistémico (LES).2 Los ac anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B constituyen el diagnóstico in-munológico del síndrome de Sjögren primario (SS) y su presencia además imprime características diferenciales al LES.1,3 Es posible que desde el punto de vista clínico el mayor valor de las determinaciones de estos acs radique en que éstas han ayudado a eliminar la entidad clínica denominada "lupus negativo de anticuerpos antinucleares" por la falta de sensibilidad de los métodos convencionales basados en la inmunofluorescencia indirecta (IFI) para la detección de los ac anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B.1,4

No obstante el desarrollo reciente de métodos de gran sensibilidad, como el ensayo inmunoenzimático con antígenos recombinantes y la inmunoimpresión inmunoblotting para la detección de los ac anti-Sm, anti-U1RNP, anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B, no se han observado diferencias significativas en la sensibilidad y especificidad de estos métodos con respecto a la contrainmunoelectroforesis (CIE), que sigue siendo el método más divulgado y recomendado para estos fines en las áreas clínicas.5,6

Una de las fuentes más comunes para la detección de los ac anti-Sm, anti-U1RNP y anti-La/SS-B es el extracto de timo de conejo, pues la respuesta autoinmune a los antígenos correspondientes no es específica de especie,7 mientras que los ac anti-Ro/SS-A reaccionan preferentemente con antígenos humanos, ya la principal fuente para su deteccción es el extracto de bazo humano.8

Debido a la creciente importancia diagnóstica que tiene la detección de las distintas especificidades de anticuerpos antinucleares (AAN) en virtud de que permiten distinguir síndromes reumáticos que se sobreponen en el plano clínico, el presente trabajo estuvo dirigido a determinar el valor diagnóstico del método de CIE para la detección de los auto-anticuerpos anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm y anti-U1RNP en pacientes afectados de LES y SS con el empleo de los extractos obtenidos de bazo humano y timo de conejo como fuente de antígenos Ro/SS-A y Sm, de U1RNP y La/SS-B, respectivamente. También fue nuestro propósito definir la relación entre los resultados de este método y los de la IFI para la determianción de AAN.

MATERIAL Y METODO

PACIENTES

Se recogieron muestras de suero de 28 pacientes diagnosticados de LES según los criterios de la Asociación Americana de Reumatismo (ARA)2 (relación hombre/mujer: 3/28, rango de edad: 16-56 años y edad promedio: 35 años). También se recogieron muestras de suero de 12 pacientes diagnosticados de SS según criterios clínicos que incluían la xeroftalmía y la xerostomía, y criterios histológicos dados por la biopsia de la glándula salival menor9 (relación hombre/mujer: 2/10, rango de edad: 44-75 años y edad promedio: 58 años).

Se recogieron muestras de suero de 31 individuos sanos donantes de banco de sangre (relación hombre/mujer: 9/22. rango de edad: 23-50 años y edad promedio: 34 años).

Los sueros de referencia anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm, anti-U1RNP y anti-ácido desoxiribonucleico de doble cadena (ADNdc), fueron donados por la Fundación "Jiménez Díaz" de Madrid y el Hospital Clínic i Provincial de Barcelona.

EXTRACTO ANTIGENICO DE BAZO HUMANO

Un bazo de donante cadáver de grupo sanguíneo "O" se homogeneizó en igual volumen a su peso de solu-ción salina fosfatada tamponada (SSFT) 0,15 M, pH 7,2. Después de la centrifugación a 15 000 g durante 30 minutos a 4 ° C se recogió el sobrenadante que se dializó con SSFT durante 18 horas a 4 ° C. Después de otra centrifugación a 10 000 g durante 10 minutos a 4 ° C, el sobrenadante se mezcló aproximadamente con el doble en volumen de DEAE (Diethylaminoethyl) celulosa DE-52. Se montó la columna, a la cual se le aplicó SSFT - NaCl 0,5 M. Las fracciones ricas en proteína se precipitaron con sulfato de amonio. El sobrenadante obtenido de la precipitación con sulfato de amonio al 35 % de saturación fue concentrado con sulfato de amonio al 60 %. Se recogió el precipitado que se redisolvió en SSFT y se dializó frente a SSFT durante 48 horas a 4 °C.10

EXTRACTO ANTIGENICO DE TIMO DE CONEJO

La obtención de este extracto fue a partir del polvo de timo de conejo (Pel Freez Biologicals, EE.UU.) que se disolvió en SSFT 0,15 M (1g/10 mL). La solución se centrifugó a 10 000 g durante 5 minutos a 4 °C y se recogió el sobrenadante.11

METODOS INMUNOLOGICOS

Los extractos de bazo humano y de timo de conejo se enfrentaron a los sueros de referencia y a los sueros problemas mediante el método de CIE descrito por Kurata N.12 Se realizó el tratamiento enzimático de los extractos hísticos para la identificación de la especificidad antinuclear de los sueros reactivos frente a cualquiera de los 2 extractos en el estudio de CIE inicial. Los extractos hísticos se incubaron en una proporción de enzima/substrato: 1/4 durante 1 hora a 37 °C con tripsina (Difco Laboratories, EE.UU.), ARNasa (Merck, Alemania) y ADNasa I (Fluka, Suiza) en concentraciones de 5 mg/mL en SSFT con cloruro de magnesio 0,006 M, y se repitió el método de CIE. La especificidad del suero problema fue asignada según los patrones de sensibilidad de los antígenos Ro/SS-A, La/SS-B, Sm, U1RNP y ADNdc a las enzimas utilizadas.12,13 La confirmación de la especificidad del autoanticuerpo se realizó por el método de CIE en el cual el suero problema y los de referencia se colocaron de forma alterna, lo que permitió la identificación de las reacciones de identidad antigénica entre ellos.

La presencia de AAN en los sueros problema se determinó por el método de IFI sobre secciones de hígado de rata realizadas en criostato.14 Los resultados se expresaron cualitativamente según el patrón de fluorescencia del núcleo.

METODO ESTADISTICO

La relación entre los resultados del método del CIE y los del método de IFI para la detección de AAN según el patrón de fluorescencia, se determinó mediante la prueba chi cuadrado (X2) con la corrección de Yates.

RESULTADOS

CARACTERIZACION DEL EXTRACTO DE BAZO HUMANO

La concentración proteica de éste fue de 7 mg/mL. Al enfrentar el extracto con los sueros de referencia solamente se observaron líneas de precipitación con los sueros anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B. Las reacciones de precipitación frente al anti-Ro/SS-A se mantuvieron hasta la dilución 1:2 del extracto, mientras que la reacción con el anti-La/SS-B desapareció con la dilución. Se tomó la dilución 1:2 como la óptima de trabajo.

CARACTERIZACION DEL EXTRACTO DE TIMO DE CONEJO

La concentración proteica de éste fue de 8 mg/mL. Al enfrentar el extracto antigénico con los sueros de referencia se observaron líneas de precipitación con los sueros anti-Sm, anti-U1RNP, anti-La/SS-B y anti-ADNdc. Las reacciones de precipitación se mantuvieron con la dilución 1:2 del extracto, excepto la reacción con el anti-ADNdc, que desapareció con la dilución. La dilución 1:4 resultó en líneas de precipitación muy tenues con los sueros anti-Sm, anti-U1RNP y anti-La/SS-B, por lo que se tomó la dilución 1:2 como la óptima de trabajo.

FRECUENCIAS DE LOS AC ANTI-RO/SS-A, ANTI-LA/SS-B, ANTI-SM Y ANTI-U1RNP EN PACIENTES CON LES Y SS EN INDIVIDUOS SANOS

Se encontraron ac precipitantes en 23 de los 71 individuos analizados: 17 con LES y 6 con SS. No se encontraron reacciones de precipitación en ninguno de los individuos sanos. Todas las reacciones de precipitación pudieron clasificarse según la especificidad inmunológica. Trece (13/23, 56,5 %) muestras de suero resultaron reactivas para más de una especificidad de autoanticuerpos y de éstas, se encontró la presencia simultánea de los 2 sistemas Ro/SS-A-La/SS-B y anti-Sm-anti-U1RNP en 4 pacientes con LES. De las 7 muestras reactivas para anti-La/SS-B, 6 también lo fueron para anti-Ro/SS-A. Las 5 muestras positivas para anti-Sm también presentaron anti-U1RNP. La distribución de los porcentajes de los AAN en los 3 grupos de individuos analizados se representa en la tabla 1.

TABLA 1. Resultados de las determinaciones de anticuerpos antinucleares por contrainmunoelec-troforesis

 
 
Pacientes
 
Lupus eritematoso sistémico 
n = 28
Síndrome Sjögren primario 
n = 12
Anti-RO/SS-A
11
39,3
6
50
Anti-La/SS-B
4
14,3
3
25
Anti-Ro/SS-A O Anti-La/SS-B
12
42,9
6
50
Anti-SM
5
17,9
0
0
Anti-U1RNP
9
32,1
0
0
Anti-SM O Anti-U1RNP
9
32,1
0
0

n: número de pacientes.

RELACION ENTRE LOS RESULTADOS DE LA DETECCION DE AAN POR IFI Y LA DETERMINACION DE LOS AC ANTI-RO/SS-A, ANTI-LA/SS-B, ANTI-SM Y ANTI-U1RNP POR CIE

Los porcentajes de los AAN determinados por IFI fueron del 85,7 % (24/28) en pacientes con LES, 33,3 % (4/12) en pacientes con SS y 3,2 (1/31) en los individuos sanos. Las 9 (100 %) muestras reactivas para anti-Sm o anti-U1RNP fueron también positivas para AAN por IFI, mientras que sólo 13 de las 18 (72,2 %) muestras reactivas para anti-Ro/SS-A o anti-La/SS-B fueron positivas para AAN por IFI. Las frecuencias de los ac anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B en las muestras de suero de LES y SS negativas para AAN se muestran en la tabla 2. El 50 % (2/4) de las muestras de LES y el 37,5 % (3/8) de las de SS negativas para AAN, presentaron ac anti-Ro/SS-A.

TABLA 2. Anticuerpos anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B en pacientes negativos de anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta

Enfermedad 
Anti-Ro/SS-A
Anti- La/SS-B
Anti-RO/SS-A o anti La/SS-B
Lupus eritematoso sistémico n = 4
2
1
2
Síndrome de Sjögren primario n = 8
3
1
3
n: número de pacientes analizados.

Se encontró asociación entre la presencia de ac anti-U1RNP y el patrón de fluorescencia granular de AAN, el cual se presentó en el 100 % (9/9) de las muestras positivas de ac precipitantes anti-U1RNP en comparación con el 29,0 % (9/31) de su presencia en las muestras negativas de ac anti-U1RNP (X2 = 11,47, p < 0,001).

DISCUSION

El presente trabajo ha demostrado la utilidad clínica del método de CIE para la detección de los autoanticuerpos anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm y anti-U1RNP con el empleo de los extractos de bazo humano enriquecido en antígeno Ro/SS-A y el del timo de conejo enriquecido en antígenos La/SS-B, Sm y U1RNP.

La CIE es reconocida en la actualidad como uno de los métodos más útiles para la detección de ac precipitantes frente a diferentes antígenos nucleares.5,6,15 Este estudio ha corroborado la utilidad de la CIE para el diagnóstico inmunológico del LES y del SS sobre la base de las frecuencias encontradas para los anticuerpos anti-Ro/SS-A, anti-La/SS-B, anti-Sm y anti-U1RNP en estas entidades clínicas, en contraste con la ausencia de estos autoanticuerpos en los individuos sanos. Los pacientes con LES se caracterizaron por la presencia de los ac anti-Ro/SS-A en el 39,3 % de ellos y de los ac anti-La/SS-B en el 14,3 %. Estas cifras se encuentran dentro del rango de las frecuencias para estos ac en el LES comunicadas por otros autores, las cuales oscilan desde el 24 %16 hasta el 50 %17 para el anti-Ro/SS-A, y desde el 9 %16 hasta el 15 %1,17 para el anti-La/SS-B.

La sensibilidad de la CIE para la detección de los ac anti-Sm y anti-U1RNP en el LES alcanzó el 17,9 % y el 32,1 %, respectivamente, lo que se corresponde con los valores encontrados en otros estudios, que oscilan desde el 5 %1 hasta el 30 %16 para el anti-Sm y desde el 23 %16 hasta el 50 %18,19 para el anti-U1RNP. La consideración del anti-Sm para la clasificación del LES2 ha sido justificada no tanto por la sensibilidad de este anticuerpo, que es inferior al 30 % en el LES según la mayoría de los estudios, como por su restricción, prácticamente exclusiva, a esta enfermedad.19 Ninguno de los pacientes con SS incluidos en este estudio fue positivo para los ac anti-Sm.

Los ac anti-Ro/SS-A y anti-La/SS-B se encontraron en el 50 % y en el 25 %, respectivamente, en los pacientes con SS. Estas frecuencias son inferiores a las publicadas por otros autores, las cuales se sitúan alrededor del 60 %1,3,6 para el anti-Ro/SS-A y del 40 %1,3,6 para el anti-La/SS-B, aunque se han comunicado frecuencias de 23 % para este último.20 Los porcentajes inferiores de estos autoanticuerpos en el SS, encontrados en este estudio, se pueden atribuir a factores como el reducido tamaño de la muestra y diferencias en los criterios para el diagnóstico del SS. No han sido evaluados todos los criterios recomendados por los grupos de Copenhagen21 y Fox R.I.,22 como sialografía y otras pruebas objetivas de producción de saliva y lágrimas. También pudo haber incidido el hecho de que la presencia de algunos ac anti-RNPs depende de factores genéticos, étnicos y ambientales.19 En cuanto a la base genética se conoce la asociación existente entre los ac anti-Ro/SS-A y determinados marcadores HLA (HLA-DR3, HLA-DR2 y HLA-DR7).23

Todos los pacientes con ac anti-Sm también presentaron el anti-U1RNP, y excepto un caso, todos los que presentaron anti-La/SS-B también fueron positivos para el anti-Ro/SS-A. Es conocida la estrecha asociación que existe entre los ac de estos 2 sistemas.19 La explicación de la concurrencia de los ac anti-La/SS-B y anti-Ro/SS-A y los anti-Sm y anti-U1RNP, es compleja. Sin embargo, ésta ha sido en parte esclarecida con los recientes estudios moleculares de sus determinantes antigénicos, que además de estar físicamente unidos sobre las mismas partículas de RNPs, presentan homología en sus secuencias aminoacídicas y por lo tanto, exhiben reactividad cruzada.24

La detección de ac anti-Ro/SS-A en este estudio incrementó la sensibilidad del diagnóstico inmunológico del LES y del SS. La CIE en búsqueda de ac anti-Ro/SS-A permitió clasificar el 50 % de los LES y el 37,5 % de los SS que resultaron negativos según la prueba de pesquisaje de los AAN por IFI. Estos resultados apoyan los de otros estudios, en los cuales un porcentaje importante de pacientes con lupus clínico, pero negativos de AAN por IFI, resultaron portadores de anti-Ro/SS-A.4 Esto se debe a la falta de expresión del antígeno Ro/SS-A en los substratos habituales como el hígado de rata utilizados en la IFI para la detección de los AAN.1,15

Se ha señalado que la mayoría de los pacientes con AAN con patrón granular de fluorescencia tienen ac anti-U1RNP.25 Los resultados de este estudio indicaron que si bien existe una estrecha asociación entre la presencia de ac anti-U1RNP y el patrón granular de fluorescencia, el cual se presentó en todas las muestras positivas de anti-U1RNP (p < 0,001), no todas las muestras con patrón granular fueron positivas para los ac anti-U1RNP. Esta observación exige cautela en la interpretación de los resultados de la detección de los AAN por IFI y destaca la necesidad de la CIE para confirmar la presencia de especificidades propias de AAN.

Los resultados de este estudio permiten concluir que un método económico como es la CIE ha demostrado ser sensible para el diagnóstico inmunológico del LES y del SS y tuvo particular importancia en los pacientes negativos de AAN por IFI. Se encontró además una estrecha asociación entre la presencia de ac anti-U1RNP y el patrón granular de AAN por IFI, aunque éste no fue indicativo de anti-U1RNP en todos los casos.

SUMMARY

The characterization of antinuclear antibodies (ANA) is essential for the diagnosis of autoimmune rheumatic diseases. Anti/Ro/ss-A, anti-La/SS-B, anti-SM, and anti-U1RNP antibodies were determined in patients presenting with systemic lupus erythematosus and primary Sjogren's syndrome by counterimmunoelectrophoresis using extracts obtained from human spleen and rabbit thymus. In the case of systemic lupus erythematosus, the frequency of anti-Ro/ss-A, anti-La/ss-b, anti-Sm, and anti-U1RNP antibodies were of 39.3 %, 14.3 %, 17.9 %, and 32.1 %, respectively. In the case of the Sjogren's syndrome, the frequency of anti-Ro/ss-A and anti-La/ss-B were of 50 % and 25 %, respectively, but neither anti-Sm nor anti-UiRNP antibodies were found. Anti-Ro/ss-A antibodies were found in 50 % of the samples of systemic lupus erythematosus, and in 37.5 % of negative samples for antinuclear antibodies using the indirect immunofluorescent test. A value of p 0.001 was found between the presence of anti-U1RNP antibodies although it was not an indicator for anti-U1RNP antibodies in all cases. These results address the diagnostic value of counterimmunoelectrophoresis for systemic lupus erythematosus and Sjogren's syndrome and support its application in clinical practice.

Key words: LUPUS ERYTHEMATOSUS, SYSTEMIC/diagnosis; SJOGRENOS SYNDROME/diagnosis; ANTIBODIES, ANTINUCLEAR/diagnostic use.

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Recibido: 26 de junio de 1995. Aprobado: 21 de agosto de 1995.

Dra. Elena Kokuina. Hospital Clinicoquirúrgico "Hermanos Ameijeiras". Ciudad de La Habana, Cuba.

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