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REV CUBANA PLANT MED 1998;3(2):58-61
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Artículos Originales

Facultad de Ciencias Médicas Dr. "Salvador Allende"

Evaluación genotóxica del extracto fluido de Indigofera suffructicosa Mill (añil cimarrón) mediante el ensayo de anomalías en la cabeza de los espermatozoides

Dr. José Betancourt Badell,1 Lic. Alberto Ramos Ruiz,2 Lic. Ángel Bizoso Parra,3 Dra. Mercedes Decalo Michelena,4 Lic. María Julia Martínez Michelena5 y Lic. Aymee Edreira Armenteros6
  1. Doctor en Ciencias Médicas.
  2. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar.
  3. Licenciado en Biología. Investigador Auxiliar.
  4. Especialista en Microbiología.
  5. Licenciada en Biología. Investigadora Agregada.
  6. Licenciada en Bioquímica.

Resumen

Se realizó la evaluación genotóxica de un extracto fluido de Indigofera suffructicosa Mill (añil cimarrón), ante la posibilidad de que el extracto indujera daño en las células germinales, mediante el ensayo de anomalías en la cabeza de los espermatozoides. Se utilizaron animales de la línea OF-1, a los cuales se les administraron por vía intragástrica 4 dosis, la dosis máxima fue de 1,857 mg/kg de peso corporal, que representa 80 % de la LD50. No se contraron diferencias significativas en el porcentaje de anomalías morfológicas de los espermatozoides, lo cual implica que no hubo actividad genotóxica.

Descriptores DeCs: EXTRACTOS VEGETALES/administración & dosificación; CABEZA DEL ESPERMATOZOIDE/efecto de droga; CELULAS GERMINATIVAS; TEST DE MUTAGENICIDAD/métodos; PLANTAS MEDICINALES.

Abstract

A genotoxic evaluation of a fluid extract from Indigofera suffructicosa Mill (añil cimarrón) was carried out to confirm if such extract could damage germ cells. Here, authors made an assay of anomalies in spermatozoon?s head, using OF-1 line animals, which given 4 doses by intragastric route, maximun dose was of 1.857 mg/kg of body weight, representing 80 percent (80 %) of LD50. There weren?t significant differences in percentage of morphologic anomalies of spermatozoon, which means that there wasn?t genotoxic activity.

Subject headings: PLANT EXTRACTS/administration & dosage; SPERM HEAD/drug effects; GERM CELLS. MUTAGENICITY TESTS/methods; PLANTS, MEDICINAL.

Las investigaciones que se realizan en la industria farmacéutica, para dar un fundamento científico al uso de las plantas medicinales, contribuyen al perfeccionamiento de fórmulas de origen vegetal. Este proceder terapéutico constituye una posibilidad más dentro de la medicina moderna, de una forma farmacéutica que puede ser efectiva con los adecuados estudios farmacológico, toxicológico, genotóxico y económico.

Los estudios de genotoxicidad constituyen un paso importante en la evaluación toxicológica de los medicamentos de orígen sintético y vegetal; estos últimos, son mezcla de sustancias con determinada acción terapéutica, sobre todo si tenemos presente la teoría de que las mutaciones pueden ocasionar procesos carcinogénicos, teratogénicos y alteraciones genéticas a la descendencia.

La especie Indigofera suffructicosa Mill, conocida como añil cimarrón, pertenece a la familia papilanaceae; es un arbusto común en toda Cuba y se cultiva preferentemente en regiones con clima cálido.1

La información etnobotánica indica que su uso popular es como insecticida contra los piojos.2 En la medicina tradicional, esta planta ha sido utilizada en el tratamiento de la epilepsia;1 esta acción se ha evidenciado mediante los estudios realizados con extractos fluidos de la planta, en modelos de epilepsia aguda (Pérez de Alejo, JL y otros. Actividad antiepiléptica del extracto fluido de Indigofera suffructicosa Mill. Trabajo presentado en el V Congreso de Farmacología, La Habana, 1993).

Existe un reporte que plantea la acción genotóxica de esta planta por un incremento del número de aberraciones cromosómicas en un sistema de ensayo con ratones.3 Además, estudios realizados en nuestro laboratorio, mediante el sistema de ensayo de inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón, por 2 vías (oral e intraperitoneal), la Indigofera suffructicosa Mill resultó genotóxica-dosis dependiente.

Nuestro propósito es evaluar la actividad tóxica y genética posible en las células germinales mediante el ensayo de anomalías de la cabeza de los espermatozoides, y con ello, contribuir al estudio de esta planta, lo que a su vez permita hacer recomendaciones sobre su uso por la población.

Métodos

Material vegetal

La planta fue cultivada en la sabana Matanzas-Varadero, cosechada en diciembre de 1992 e identificada con el número de Herbario 4594 en la estación experimental de Plantas Medicinales "Dr. Juan Tomás Roig", ubicada en Güira de Melena, La Habana.

El extracto fluido estudiado se elaboró a partir de las partes aéreas de la planta (tallo, hojas y frutos) en el laboratorio de Medicina Herbolaria del Hospital "Luis Díaz Soto". 4

Las características físico-químicas del extracto fluido del añil cimarrón son: sólidos totales, 129,4 mg/mL (menstruo etanólico 24,10 %), índice de refracción - 1,3785, densidad relativa - 1,0591, pH 7,05 y etanol 25 %.

Reactivos

Para los reactivos empleados en el desarrollo experimental se señala la procedencia como: ciclo fosfamida, Asta Werke Art. 059778, Eosina Y, Merck-Darmstadt Art. 1345.

Ensayo de anomalías en la cabeza de los espermatozoides

La prueba se realizó en ratones albinos OF-1, procedentes del Centro Nacional de Producción de Animales de Laboratorio (CENPALAB). Antes del tratamiento, los animales se sometieron a un período de adaptación durante una semana en el bioterio de la Facultad de Medicina Dr. "Salvador Allende", donde vieron libre acceso a la dieta (pienso peletizado) y al agua.

Para la prueba se establecieron 7 grupos de 8 animales cada uno: control de frecuencia espontánea, control de solvente (etanol al 25 %), tratamientos (4 grupos) y control positivo (50 mg/kg/pc/día) al comienzo del ensayo, los ratones tenían 9 semanas de nacidos y un peso de 32,4 ± 4,7 g.

En cuanto a los tratamientos, se aplicó una dosis máxima de 1,897 g/kg pc, que representa 80 % de la LD50 determinada de manera experimental para los machos (2,37 g/kg).

En todos los casos, el esquema de tratamiento fue de 5 aplicaciones por vía oral, separadas 24 h entre sí. A los 35 d de la primera aplicación, una vez que los espermatocitos primarios de los animales tratados llegan a espermatozoides maduros en los epidídimos, se procedió al sacrificio por dislocación cervical. Se determinó el peso de los testículos y los epidídimos, así como se separó la porción distal de estos últimos y se prepararon suspensiones de espermatozoides.5

En una alícuota de estas suspensiones se realizó el conteo de células presentes, el resto se tiñó con eosina al 1 % e hizo la extensión en 2 láminas por animal. La evaluación se realizó en láminas codificadas, observadas en un microscopio Zeiss, bajo un aumento de 400X; al menos 1 000 espermatozoides se analizaron por animal. Para la clasificación se siguió el criterio de Wyrobex y Bruce,6 basado en cabezas normales, amorfas, bananas y sin gancho.

Para la evaluación estadística, los valores se procesaron mediante un análisis de varianza de 2 vías.

Resultados

En la tabla 1 se recogen los resultados generales de la evaluación del extracto fluido de Indigofera suffructicosa Mill en este ensayo.

Tabla 1. Efecto del extracto. Fluido de Indigofera suffructicosa Mill sobre la frecuencia de cabezas anormales de los espermatozoides de ratón

 
Mortalidad
No. de animales
Ganancia en peso de los testículos y Espermatozoides
 
Tratamiento 
Peso a (g)
Epidídimo (g)
Epidídimos (g) (x106)
Espermatozoides Anormales(%)
Control negativo          
Etanol 25 %
0/8
+ 3,42
0,30 + 0,06
4,40 ± 1,73
13,77 ± 3,54
Control frecuencia espontánea
0/8
+ 3,27
0,35 ± 0,05
5,01 ± 2,45
12,29 ± 2,63
Extracto fluido de indigofera suffructicosa Mill. Dosis (g/kg pc/día)          
0,474
0/8
+ 2,74
0,27 ± 0,06
3,31 ±1,29
13,37 ± 1,99
0,948
0/8
+ 3,9
0,35 ± 0,06
5,97 ± 1,25
15,68 ± 4,39
1,422
0/8
+ 2,36
0,32 ± 0,03
3,6 ± 0,98
12,61 ± 2,42
1,897
0/8
h+ 3,30
0,29 ± 0,06
3,31 ± 2,51
14,10 ± 4,81
Control positivo ciclofosfamide (50 mg/kg pc/día)
0/8
+ 2,31
0,29 ± 0,35
1,00 ± 0,48*
28,87 ± 2,62**
* P < 0,05:
** P < 0,01
a Observada al finalizar la experiencia (35 días).

No se observa mortalidad en ninguna de las dosis utilizadas, así como no se manifiesta toxicidad relacionadas con disminución del peso corporal; tampoco se observan diferencias en el peso de los testículos y epidídimos.

No se aprecia disminución significativa del conteo de espermatozoides con el incremento de la dosis, los valores más bajos son los del tratamiento con ciclofosfamida.

Con las dosis utilizadas no se observa un aumento en la proporción de cabezas aberrantes. En relación con los tipos de anomalía predominantes (tabla 2), el aumento observado obedece en su mayoría al incremento en la proporción de cabezas amorfas.

Tabla 2. Tipos de malformaciones en la cabeza de los espermatozoides de ratones tratados con extracto fluido de Idigofera suffructicosa Mill
 
Porcentaje de tipos anormales
Tratamiento 
Sin gancho
Bananas
Amorfos
Control negativo etanol 25 %
4,40 + 0,88
1,37 + 1,10
8,00 + 2,72
Control frecuencia espontánea
4,09 ± 1,15
1,41 ± 0,97
6,78 ± 1,53
Extracto fluido de indigófera suffructicosa Mill. Dosis (g/kg pc/día)      
0,474
4,87 ± 0,84
1,00 ± 0,76
7,58 ± 1,11
0,948
5,46 ± 1,32
1,89 ± 1,40
8,31 ± 3,91
1,422
4,06 ± 1,11
1,38 ± 1,10
7,16 ± 1,65
1,897
4,41 ± 2,06
1,92 ± 1,21
7,71 ± 2,39
Control positivo ciclo fosfamida (50 mg/kg/día)
9,56 ± 0,87*
5,49 ± 1,06*
13,11 ± 1,18*
* p < 0,05

Discusión

No se encontraron elementos de citotoxicidad, ni variaciones en la proporción de cabezas anormales; sin embargo, existe un reporte en la literatura que plantea la acción genotóxica de un extracto acuoso del añil cimarrón en la dosis de 1,250 mg/kg de peso durante el ensayo de aberraciones cromosómicas en la médula ósea de ratón.3 En el ensayo de inducción de micronúcleos en la médula ósea de ratón, realizado en nuestro laboratorio, por las vías intragástrica e intrapentoneal, se encontraron diferencias significativas en la dosis más elevada (1,012 mg/kg pc) con el extracto fluido del añil cimarrón.

Esto evidencia que la genotoxina no atraviesa la barrera sangre-célula sertoli y por tanto, no interactúa en las células germinales.7

Conclusiones

  1. En las condiciones de ensayos descritas, el extracto fluido al 25 % de indigofera suffructicosa Mill no presentó acción genotóxica, ya que no indujo un incremento significativo en las anomalías morfológicas de los espermatozoides.
  2. Con los resultados encontrados en la prueba en vivo (test de micronúcleos), que indican un daño mutacional, la prueba de anomalías de la cabeza de los espermatozoides no es concluyente al respecto, no así el test de dominantes letales.

Agradecimientos

A la Licenciada Marisol López Barreiro por su colaboración brindada.

Referencias Bibliográficas

  1. Roig JT. Plantas medicinales, arómaticas o venosas de Cuba. La Habana: Ciencia y Técnica. Instituto del Libro, 1974:315-6.
  2. Aguilar-Contreras A, Zolla C. Plantas tóxicas de México. División de información etnobotánica. México: Unidad de investigación biomédica en medicina tradicional y herbolaria del Instituto Mexicano del seguro social, 1982:118-20.
  3. Ribeiro LR et al. Toxicological and toxicogenetic effect of plants used in popular medicine and cattle food. Mem Inst Osvaldo Cruz, 1991;86:89-91.
  4. Soler B. NRSP 331. Procesos tecnológicos. En normas ramales de medicamentos de origen vegetal, tinturas y extractos fluidos. Ciudad de La Habana, MINSAP, 1991.
  5. Wyrobek AJ, Bruce WR. Chemical induction of sperm abnormalities in mice. Proc Natl Acad Sci 1975;72:4425-9.
  6. _____. The induction of sperm shape abnormalities in mice and humans. In De Serres A, Hollaender (eds) Chemical mutagens principles and methods for their detection. New York: Plenum, 1978; Vol. 5:257-85.
  7. Wyrobek AJ et al. An evaluation of the sperm morphology test and other sperm test in humans. Mut Res 1983;115:73-148.
Recibido: 17 de septiembre de 1997. Aprobado: 19 de septiembre de 1997.

Dr. José Betancourt Badell. Facultad de Ciencias Médicas Dr. "Salvador Allende". Carvajal s/n esquina Agua Dulce. Cerro, Ciudad de La Habana, Cuba.

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