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REV CUBANA PLANT MED 1998;3(3):27-30
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Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Departamento de Investigaciones Microbiológicas

Evaluación del potencial genotóxico de un extracto fluido de albahaca morada (Ocimum tenuiflorum L.)

Lic. Alberto Ramos Ruiz,1 Lic. Angel Vizoso Parra,2 y Lic. Aymée Edreira Armenteros3

Resumen

Se procedió a evaluar la posible actividad genotóxica de un extracto fluido de Ocimum tenuiflorum L. (albahaca morada), preparado con un menstruo alcohólico al 70 %. Se emplearon 3 pruebas: test de Ames, segregación mitótica en Aspergillus nidulans e inducción de micronúcleos en médula ósea de ratón. En el ensayo de Ames no se observó respuesta positiva en el rango de 50 a 5 000 mg de sólidos totales/placa. En la prueba de segregación mitótica, se evaluaron concentraciones en un rango de 2,5 a 250 mg de sólidos totales/mL, sin encontrar incrementos significativos en la frecuencia de sectores segregantes por colonia. En el test de micronúcleos, se hicieron 2 administraciones orales de los extractos, separadas 24 h entre sí, con sacrificio 24 h después de la última aplicación. Las dosis fueron de 0,5; 1,0 y 2,0 g/kg pc (peso corporal). No se detectaron aumentos significativos en la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados (mPCE).

Descriptores DeCS: TEST DE MICRONUCLEOS; PLANTAS MEDICINALES; aspergillus nidulans; ratones; salmonella typhimurium.

Abstract

Authors assessed potential genotixoc activity of a fluid extract from Ocimum tenuiflorum L. (purple basil), prepared with an alcoholic menstruum (70 %). We used three tests: Ames´s assay mitotic segregation in Aspergillus nidulans and micronuclei induction in bone marrow of mouse. In Ames´s assay, there wasn´t positive response in the rank of 50 to 5 000 µg of total solids/plate. In the test of mitotic segregation, concentrations in a rank of 2,5 to 250 mg of total solids/mL, were assessed, without significant increases in frequency of segregatins sectors by colony. In micronuclei test, we performed two administrations of extracts, elapsing 24 hours between each other; animals were sacrificed after last application. Dose were of 0.5; 1.0, and 2.0 g/kg of body weight (BW). Significant increases in frequency of micronucleated polichromatic erithrocytes (mPCE) weren´t detected.

Subject headings: MICRONUCLEUS TESTS; PLANTS MEDICINAL; ASPERGILLUS NIDULANS; MICE; SALMONELLA TYPHIMURIUM.

La albahaca morada (Ocimum tenuiflorum L.), conocida en Cuba también como albahaca cimarrona y albahaca morada criolla, es una especie empleada en la medicina tradicional como antiasmático, antiespasmódico, hipotensor, analgésico, antipirético, antiinflamatorio, hepatoprotector, sedante e hipoglicemiante.1 Este último efecto ha sido valorado y comprobado experimentalmente.2-4

Como parte de las investigaciones farmacológicas y toxicológicas auspiciadas por el Programa Nacional de Plantas Medicinales, encaminado a fundamentar científicamente los usos tradicionales atribuidos a la flora cubana, se realizó un estudio para evaluar el potencial mutagénico de un extracto fluido de esta planta. Para ello se usaron 3 ensayos: la prueba de Ames, que detecta mutaciones génicas, el ensayo de segregación somática en diploides heterocigóticos de Aspergillus nidulans que mide inducción de recombinación mitótica y mala segregación de cromosomas in vitro y el test de micronúcleos, un ensayo ampliamente validado internacionalmente que evalúa daño genético causado por agentes clastogénicos y aneugénicos in vivo.

Métodos

Material vegetal

La planta se cultivó en la Estación Experimental de Plantas Medicinales «Dr. Juan Tomás Roig». Se colectó en septiembre de 1996. Un ejemplar de la misma se conserva en el herbario de la institución con número ROIG 00019. El extracto fluido (lote 4) se preparó con el follaje de la planta, empleando alcohol al 70 % como menstruo,5 en octubre de 1996. El extracto contenía 4,6 mg/mL de sólidos totales, 59,09 % de etanol, 0,185 % de aceite esencial y 60 % de eugenol en el aceite esencial.

Ensayo de Ames

Se empleó una batería de 4 cepas de Salmonella typhimurium: TA 1535, TA 1537, TA 98 y TA 100, enviadas por el doctor Bruce N. Ames (Universidad de California en Berkeley, USA). Se usó el método de incorporación en placa, en concentraciones del extracto de 50 a 5 000 µg de sólidos totales/placa. El ensayo se realizó según protocolos bien estandarizados.6 Se probaron 5 concentraciones, sembrándose 3 placas por cada concentración en un experimento único. La prueba se realizó en presencia y ausencia de activación metabólica externa (mezcla S9 al 4 % de concentración final, preparada con fracción posmitocondrial de hígado de ratas tratadas con fenobarbital y 5,6 benzoflavona). Las placas se incubaron a 37 EC y se contaron las colonias revertantes a las 48 h.

Ensayo de segregación mitótica en Aspergillus nidulans

La prueba se realizó según lo descrito anteriormente.7 Se emplearon concentraciones de 2,5 a 250 µg de sólidos totales/placa.

Test de micronúcleos

El extracto fluido se evaporó a presión reducida para eliminar el etanol y el sólido resultante se resuspendió en etanol al 60 % a una concentración de 200 mg/mL. Se establecieron 7 grupos experimentales: control negativo (etanol al 60 %), control positivo (ciclofosfamida, 20 mg/kg en dosis única, 24 h antes del sacrificio) y 5 dosis de 250, 500, 1 000, 1 500 y 2 000 mg/kg. Cada grupo contó con 10 animales, 5 de cada sexo. Se emplearon ratones suizos de la colonia del Laboratorio de Control Biológico del CIDEM, con 5 semanas de nacidos y un peso de 25,8 ± 2,6 g. El extracto se aplicó por vía oral a razón de 10 mL/kg, en 2 dosis separadas 24 h y se procedió al sacrificio 24 h después de la última aplicación. Para el sacrificio de los animales tratados con extracto se escogieron 3 grupos de acuerdo con la mortalidad observada en los mismos al cabo de 48 h de iniciada la experiencia. Sólo hubo un animal muerto a las 48 horas en la dosis máxima, por lo cual se seleccionó 2 000 mg/kg como dosis tope y las de 1 000 y 500 mg/kg como las restantes que representan el 50 y el 25 % respectivamente de la dosis más alta.8 El sacrificio de los animales, así como el muestreo, procesamiento y evaluación de las extensiones de médula ósea se realizó de acuerdo con la metodología establecida.7

Resultados

La tabla 1 resume los resultados del ensayo de Ames. Como puede observarse, hasta 5 mg/placa (valor que se acepta como límite superior de exposición en ausencia de toxicidad o problemas de solubilización9) no hubo incremento dosis-dependiente de la frecuencia de revertantes por colonia (indicador de mutagenicidad en el ensayo), para ninguna de las cepas de Salmonella empleadas.
TABLA 1. Ensayo de Ames en Salmonella typhimurium para el extracto fluido de Ocimun tenuiflorum L
 
Revertantes/placa ±DE
Concentración 
TA 1535
TA 1537
TA 98
TA 100
(mg/placa)
-S9 
+S9
-S9
+S9
-S9
+ S9
-S9
+S9
0
10,0 ± 1,7
15,3 ± 0,6
13,0 ± 3,6
11,7 ± 4,2
34,7 ± 4,0
43,7 ± 3,2
136,7 ± 6,2
156,0 ± 10,4
50
12,5 ± 3,1
21,0 ± 3,6
10,3 ± 3,6
17,3 ± 4,6
28,3 ± 2,5
40,0 ± 5,0
152,5 ± 6,4
170,7 ± 5,0
150
13,7 ± 4,5
23,3 ± 3,2
9,0 ± 4,4
14,7 ± 3,8
32,3 ± 5,9
36,0 ± 5,6
156,0 ± 5,2
163,3 ± 20,8
500
9,7 ± 1,5
20,0 ± 2,6
10,3 ± 0,6
12,7 ± 1,5
30,0 ± 3,5
34,0 ± 6,6
142,7 ± 27,7
158,0 ± 32,1
1 500
9,0 ± 2,0
13,7 ± 3,2
14,0 ± 9,6
17,0 ± 1,4
32,0 ± 10,5
32,0 ± 10,3
137,3 ± 12,7
159,7 ± 12,7
2 000
12,7 ± 5,0
15,3 ± 5,1
6,7 ± 0,6
8,3 ± 1,5
34,0 ± 3,5
28,3 ± 1,2
110,7 ± 19,4
123,3 ± 20,0
Controles positivos
1 347,5 ± 23,9**
203,7 ± 33,5**
37,3 ± 11,0**
40,0 ± 2,6**
1216,0 ± 419,4**
3146,7 ± 92,4**
1200,0 ± 30,0**
3120,0 ± 288,4**
** p < 0,01 (test de Student).

1 Controles positivos: -S9: azida de sodio, 1,5mg/placa para las cepas TA 1535 y 100; ácido picrolónico, 100 mg/placa para la cepa TA 98; ICR 170, 10 mg/placa para la cepa TA 1537; +S9: 2 aminofluoreno para las cepas TA 1537, TA 98 y 100; ciclofosfamida, 500 mg/placa para la cepa TA 1535.

Los resultados obtenidos para el test de Aspergillus nidulans aparecen en la tabla 2. Como se observa, no se obtuvieron diferencias significativas para ningún tratamiento en el ANOVA (P = 0,0796), en un intervalo donde se observó toxicidad cuantitativa apreciable. En el análisis de regresión lineal tampoco se observó relación entre la concentración y la frecuencia de sectores por colonia (FSC) (P = 0,5628).

TABLA 2. Segregación mitótica en Aspergillus nidulans frente al extracto fluido de Ocimum tenuiflorum L.
     
Genotoxicidad
Concentración
(mg/mL) 
Colonias
Toxicidada
Sectores segregantes
FSCb
Etanolc
20
 
46
2,30 ± 1,63
No tratados
20
 
39
2,05 ± 1,35
2,5
20
3,36
41
2,15 ± 1,61
7,5
20
7,00
66
3,30 ± 1,89
25,0
20
6,16
39
1,90 ± 1,61
75,0
20
15,40
57
3,00 ± 1,67
250,0
20
17,36
48
2,67 ± 1,53
MMS 2,4 mMd
20
32,21
159
7,95 ± 2,37**
a Reducción del diámetro de las colonias (en porcentaje) a las 72 h respecto al control negativo. b Frecuencia de Sectores por Colonia.c Control negativo, etanol al 14 %.d Control positivo, metilmetano sulfonato.

** p < 0,01.

Regresión lineal: FSC = 0,0017. (concn.) + 23976; r = 0,3005; P = 0,5628.

Los resultados del ensayo in vivo (test de micronúcleos) aparecen en las tablas 3 y 4. Sólo se observaron diferencias en cuanto a la proporción entre eritrocitos policromáticos (PCE) y normocromáticos (NCE) entre sexos (P < 0,001), siendo mayor en el caso de los machos. En ningún caso se observaron diferencias entre control y dosis para la relación PCE/NCE ni la frecuencia de PCE micronucleados (NPCE/1 000PCE). Tampoco la prueba de Cochran para tendencias en las proporciones lineales en el valor de MNPCE respecto a las dosis ensayadas arrojó resultados significativos en cada caso.

TABLA 3. Resumen del test de micronúcleos en ratones machos tratados con extracto de Ocimum tenuiflorum L.
Tratamiento (mg/kg/día) 
PCE/NCE ± DS
MNPCE/1 000 PCE ± DS
Controles    
Etanol al 60 %
2,28 ± 0,69
1,40 ± 1,39
Ciclofosfamida, 20 mg/kg
0,41 ± 0,20**
12,30 ± 6,80**
Extracto de O. Tenuiflorum    
500
2,28 ± 0,20
1,80 ± 0,90
1 000
1,91 ± 0,67
1,30 ± 0,76
2 000
2,92 ± 0,97
1,40 ± 0,42
   
P = 0,6126a
a Valor de P para la regresión de Cochran-Armitage; ** p < 0,01 (test de Student).

TABLA 4. Resumen del test de micronúcleos en ratones hembras tratados con extracto de Ocimum tenuiflorum L.

Tratamiento (mg/kg/día)
PCE/NCE ± DS
MNPCE/1 000 PCE ±DS
Controles    
Etanol al 60 %
1,38 ± 0,64
1,20 ± 0,90
Ciclofosfamida, 20 mg/kg
1,85 ± 0,70
0,80 ± 2,30
Extracto de O. tenuiflorum    
500
1,19 ± 0,67
1,30 ± 0,57
1 000
1,32 ± 0,53
1,10 ± 0,96
2 000
1,48 ± 0,51
0,90 ± 0,42
   
P = 0,7827a
aValor de P para la regresión de Cochran-Armitage; ** p < 0,01 (test de Student).

Discusión

Tal como puede observarse a partir de los resultados, el extracto fluido de albahaca morada estudiado no induce efectos mutagénicos en los sistemas de ensayo donde se evaluó. Las diferencias en la razón PCE/NCE entre sexos no influyen en los resultados de genotoxicidad obtenidos, negativos en ambos casos.

Entre los componentes químicos del follaje de esta planta, no se encuentra ninguno que haya sido reportado como genotóxico: ácidos grasos, esteroles, eugenol, metileugenol, cariofileno, glicósidos de apigenina y luteolina, b-caroteno, ácido ursólico, etc. En cuanto al eugenol, mayoritariamente presente en el aceite esencial, las evidencias de mutagenicidad se circunscriben a los ensayos citogenéticos in vitro,10 siendo los resultados negativos al tratar de confirmarlos in vivo,11 excepto cuando se emplean concentraciones mayores de 400 mg/kg (ensayo de micronúcleos),12 que superan con creces la posible exposición alcanzada con este extracto fluido de albahaca morada (teóricamente de unos 0,222 mg/kg). Por otra parte, se sabe que la clorofila y los carotenoides presentes en éste, ejercen acción antimutagénica en numerosos sistemas experimentales in vitro e in vivo, lo que pudiera contribuir adicionalmente a la ausencia de mutagenicidad observada. De hecho, se ha reportado que un extracto acuoso de hojas de esta planta posee propiedades radioprotectoras en unos ratones irradiados a dosis de 1 a 6 Gy, a los que se administró el extracto por vía intraperitoneal durante 5 d, al observarse disminución en el porcentaje de células aberrantes en médula ósea de los ratones con la planta en comparación con los controles. Se plantea que esto último puede estar vinculado a una reducción efectiva en los niveles de radical OH y a la reparación del daño genético inducido por la radiación mediado por GSH.13 En cuanto a lo primero, se tienen evidencias experimentales de una potente acción antioxidante in vitro en una fracción hidroalcohólica de la planta, con disminución de los niveles de radicales hidróxilo y superóxido.14

Referencias Bibliográficas

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  2. Deas M, Menéndez R, Álvarez A, González RM. Efecto hipoglicemiante de la albahaca morada. Rev Cubana Invest Bioméd 1988;7:53-9.
  3. Crespo S, Güel E, Menéndez R, González RM. Estudio del mecanismo de acción hipoglicemiante de la albahaca morada (Ocimum sanctum L.) II. Rev Cubana Farm 1988;22:86-91.
  4. González RM, Crespo S, Deas M. Estudio del mecanismo de acción hipoglicemiante de la albahaca morada (Ocimum sanctum L.) III. Rev Cubana Farm 1988;22:92-100.
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  11. Maura A, Pino A, Ricci R. Negative evidence in vivo of DNA-damaging, mutagenic and chromosomal effects of eugenol using the bone marrow micronucleus assay. Mutat Res 1989;227:125-9.
  12. Ellalueñe MF, Pérez-Alzola LP, Orellana-Valdebenito M, Muñoz C, Lafuente-Indo N. Genotoxic evaluation of eugenol using the bone marrow micronucleus assay. Mutat Res 1994;320:175-80.
  13. Ganasoundari A, Uma Devi P, Rao MNA. Protection against radiation-induced chromosome damage in mouse bone marrow by Ocimum sanctum. Mutat Res 1997;373:271-6.
  14. Maulik G, Maulik N, Bhandari V, Kagan VE, Pakrashi S, Das DK. Evaluation of antioxidant effectiveness of a few herbal plants. Free Rad Res 1997;27:221-8.
Recibido: 22 de septiembre de 1998. Aprobado: 8 de octubre de 1998.

Lic. Alberto Ramos Ruiz. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM). Departamento de Investigaciones Microbioló-gicas. Ave 26 # 1605, Nuevo Vedado. CP 10600.

  1. Licenciado en Bioquímica. Investigador Auxiliar.
  2. Licenciado en Biología. Investigador Auxiliar.
  3. Licenciada en Bioquímica. Aspirante a Investigador.
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