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Universo Diagnóstico 2000;1(2):18-21
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Determinación de anticuerpos anti-DNA de doble cadena sobre preparación nacional de Crithidia luciliae

Dra. Elena Kokuina,1 Lic. Igrid García,2 Lic. Javier Suarez,2 Dra. Aracelis Chico3y Dra. Nelsa Casas4
 

RESUMEN

Se cultivó el hemoflagelado Crithidia luciliae con el objetivo de desarrollar un método para la determinación de anticuerpos anti-DNA de doble cadena (dc) séricos. Se prepararon láminas portaobjetos, que fueron utilizadas para la detección de estos anticuerpos por el método de inmunofluorescencia indirecta en 124 muestras de suero de pacientes con enfermedades autoinmunes reumáticas. Se compararon los resultados de las preparaciones con los obtenidos sobre láminas comerciales. Solo 4 muestras fueron discordantes, y se obtuvo un coeficiente Kappa de 0.92. Estos resultados demostraron el valor diagnóstico de estas preparaciones para la detección de anticuerpos anti-DNAdc.

Palabras clave : Autoanticuerpos anti-DNA de doble cadena, Inmunofluorescencia, Enfermedades autoinmunes reumáticas, lupus eritematoso sistémico.
 
 

La detección de los anticuerpos anti-DNA doble cadena (dc) es esencial en el estudio de las enfermedades autoinmunes reumáticas. Además de su importancia diagnóstica en estas condiciones clínicas, estos anticuerpos probablemente desempeñan un papel en la patogenia de algunas de estas enfermedades, como el lupus eritematoso sistémico.

Uno de los métodos utilizados en la actualidad para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc es la inmunofluorescencia indirecta sobre el protozoo Crithidia luciliae, cuyo DNA circular y en forma de hélice está contenido dentro del mitocondrión gigante desplazado hacia uno de sus polos, llamado cinetoplasto. Como la Crithidia es un organismo procariota, de núcleo pobremente organizado y carente de membrana nuclear, es un substrato inadecuado para la detección de los anticuerpos antinucleares en su totalidad. Por lo tanto, los anticuerpos anti-DNAdc presentes en el suero del paciente reaccionaran únicamente con el cinetoplasto, esto se puede revelar por la técnica de inmunofluorescencia.1

En este trabajo se probó el valor clínico de nuestras preparaciones de Crithidia luciliae para la determinación de los anticuerpos anti-DNAdc mediante la comparación de los resultados con los de un método comercial.1


MÉTODOS

Preparación de láminas portaobjetos con Crithidia luciliae: Se cultivó la Crithidia luciliae donada por el profesor L.A. Aarden (Red Blood Transfusion Service, Amsterdam) en medio de cultivo modificado respecto al original,2 bajo condiciones de vigorosa agitación a 24 oC durante 48 h. A partir de este, se preparó un segundo cultivo hasta que la concentración del parásito alcanzó de 20-40 x 106 células/mL. Después de 2 lavados con solución salina fosfatada tamponada (PBS) con 1 mg/mL de albúmina bovina, las células fueron resuspendidas en una solución de albúmina bovina (1 mg/mL) en agua destilada a una densidad de 10x106 células/mL. Después de 10 min la suspensión fue filtrada y aplicada en fracciones de 20 mL a los espacios sobre la lámina portaobjetos. Las láminas fueron secadas y fijadas en etanol 96 % durante 10 min. Las preparaciones fueron conservadas hasta su utilización a –20oC . Parte del cultivo celular se criopreservó en medio de cultivo con DMSO 7 % en nitrógeno líquido.

Pacientes: Se estudiaron las muestras de suero de 124 pacientes adultos del Servicio de Reumatología del Hospital Clínicoquirúrgico “Hermanos Ameijeiras“ con indicación clínica de búsqueda de anticuerpos anti-DNAdc. Los sueros se conservaron a –20 oC hasta su utilización.

Determinación de anticuerpos anti-DNAdc: Se realizó simultáneamente sobre láminas preparadas en el laboratorio y láminas comerciales (Biosystem, Barcelona) y dividida en 8 ensayos. Se empleó el método de inmunofluorescencia indirecta (IF), para lo cual los sueros se aplicaron diluidos 1:10 en PBS sobre el substrato antigénico fijado en las láminas portaobjetos y la presencia de los anticuerpos anti-DNAdc se demostró por la incubación de las muestras con antisuero antiinmunoglobulinas humanas (IgA, IgG, IgM), conjugado con isotiocianato de fluoresceina (Sigma BioSciences, St. Louis).

Después de aplicar el medio de montaje las muestras fueron observadas en el microscopio de fluorescencia. La brillantez del mitocondrión de la Crithidia luciliae permitió clasificar la muestra como positiva para los anticuerpos anti-DNAdc.

Los resultados de ambos métodos se compararon mediante la prueba de chi cuadrado (X2) y se determinó el coeficiente de concordancia Kappa.


RESULTADOS

De las 124 muestras de suero estudiadas, 90 (72,58 %) resultaron negativas y 34 (27,42 %) resultaron positivas para los anticuerpos anti-DNAdc por el método de inmunofluorescencia con las láminas comerciales de Crithidia luciliae.

Se obtuvieron resultados idénticos para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc sobre las láminas comerciales y las nuestras en 120 de las 124 muestras de suero de pacientes con enfermedades reumáticas, lo que se correspondió con un X2 de 104,7, p < 0,01, y un coeficiente de concordancia Kappa de 0,92,p< 0,01 (fig.1). De las 34 muestras clasificadas como positivas para los anticuerpos anti-DNAdc por las láminas comerciales, 32 lo fueron también sobre las láminas nuestras (fig. 2); mientras que de las 90 muestras negativas para los anti-DNAdc por las preparaciones comerciales, 88 resultaron negativas también sobre nuestras preparaciones de Crithidia luciliae (fig. 3).
 

X2 = 104,7
p < 0,01
K = 0,92
p < 0,01
Fig 1. Los resultados de la detección de los anticuerpos anti-DNAdc por las láminas comerciales de la Crithidia luciliae (Biosystems) y las preparaciones del laboratorio fueron iguales en 120 de las 124 (96,77 %) muestras de sueros de pacientes con enfermedades reumáticas.
 

Fig 2. De las 34 muestras positivas para anticuerpos anti-DNAdc por las preparaciones comerciales de la Crithidia luciliae (Biosystem), 32 (94,11 %) fueron detectadas por las láminas del laboratorio.
 
 

Fig 3. De las 90 muestras negativas para anticuerpos anti-DNAdc por las láminas comerciales de Crithidia luciliae (Biosystems), 88 (97,77 %) también lo fueron por las preparaciones del laboratorio.
 
 

DISCUSIÓN

Las técnicas para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc séricos se han hecho imprescindibles en los laboratorios clínicos. Estos anticuerpos se presentan en distintas enfermedades autoinmunes y niveles elevados de anticuerpos anti-DNAdc están fuertemente asociados con el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico. Entre 60 y 83 % de pacientes con lupus eritematoso presentan en su circulación anticuerpos anti-DNAdc en algún período de tiempo durante su evolución. La presencia de los anticuerpos anti-DNAdc séricos es una de las 3 alteraciones inmunológicas necesarias para la clasificación del lupus eritematoso sistémico según los criterios del Colegio Americano de Reumatología, los cuales han sido revisados en 1997.4  Los anticuerpos anti-DNAdc son los de más probado papel patogénico que causan mediante diversos mecanismos el daño renal del lupus.Se ha encontrado que los aumentos en los niveles séricos de anticuerpos anti-DNAdc preceden las exacerbaciones del lupus, y están particularmente, relacionados con el riesgo de glomerulonefritis lúpica. Por lo tanto, mientras que las mediciones puntuales de los anticuerpos anti-DNAdc son útiles para establecer el diagnóstico del lupus, las mediciones seriales de estos autoanticuerpos pueden ser importantes para evaluar la actividad de la enfermedad.5-7

El propósito de este trabajo ha sido introducir en la práctica clínica un método útil para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc. En la actualidad los métodos más utilizados para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc en la clínica son el radioinmunoanálisis (RIA) de Farr, el ensayo inmunoenzimático (ELISA) y la inmunofluorescencia sobre el protozoo Crithidia luciliae.7 El método de inmunofluorescencia que utiliza como fuente antigénica la Crithidia luciliae, resulta muy atractivo, porque aunque es menos sensible que el RIA y el ELISA, su mayor ventaja es su gran especificidad, pues casi exclusivamente detecta anticuerpos anti-DNAdc, en virtud de que este microrganismo posee un miticondrión gigante rico en DNAdc, a diferencia de los substratos antigénicos de RIA y ELISA, los cuales pueden estar contaminados con DNA de cadena simple (DNAsc). Los anticuerpos anti-DNAsc carecen de valor diagnóstico y pueden proporcionar resultados falsos positivos que confunden el diagnóstico del paciente.8,9 Otro factor a considerar es el alto costo de los juegos diagnósticos comerciales de RIA y ELISA para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc, asi como resultan también costosas y complejas la obtención del DNAdc de fuentes bacterianas y de mamíferos, y el desarrollo de estas tecnologías en el nivel del laboratorio; mientras que la preparación de láminas con Crithidia luciliae resulta simple, rápida y económica. 9,10 El cultivo de este parásito no patógeno para el hombre, no es complejo, y su rápida reproducción ha permitido disponer de una alta concentración de microorganismos en solo unos pocos días, aún con un medio de cultivo modificado por sustitución de algunos de sus componentes respecto al utilizado por Aarden L.A. 2,10

Las preparaciones funcionaron de igual forma que las láminas comerciales de Crithidia luciliae para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc cuando se evaluaron muestras de 124 pacientes con enfermedades autoinmunes reumáticas. La comparación de los resultados se correspondió con un coeficiente de concordancia Kappa de 0,92, ( p < 0,01).

Estos resultados permiten introducir el método de inmunofluorescencia sobre Crithidia luciliae desarrollado para la detección de los anticuerpos anti-DNAdc en la práctica clínica, lo que amplía y consolida el diagnóstico inmunológico de las enfermedades autoinmunes y en particular del lupus eritematoso sistémico en Cuba.
 

 SUMMARY

For determining the serum anti DNA antibodies of double chain the hemoflagellate Crithidia Luciliae was cultured and slides were prepared, and used for detecting such antibodies by the method of indirect immunofluorescence in 124 serum samples from patients suffering autoimmune rheumatic diseases. The results of the local preparations were compared with the ones obtained with commercial slides. Only 4 samples disagreed, a Kappa coefficient of 0.92  was obtained. These results showed the diagnostic values of our preparations for detecting Anti-DNA antibodies.

Keywords: Anti-DNA antibodies of double chain, immunofluorescence, rheumatic autoimmune diseases, erythematous systemic lupus.
 
 

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

  1. Smeenk RJT, van der Brink HG, Brinkman K, Termaat RM, Berden JHM, Swaak AJG. Anti-dsDNA: choice of assay in relation to clinical value. Rheumatol Int 1991; 11:101-7.
  2. Aarden LA, Smeenk RJT. Measurements of antibodies specific for DNA. Immunol Methods. vol II. Nueva York: Academic Press, 1981:75-82.
  3. Quismorio FP Jr. Clinical application of serologic abnormalities in systemic lupus erythematosus. En: Wallace DJ,Hahn BH, eds. Dubois’ lupus erythematosus.5ta. Ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1997: 925-42.
  4. Hochberg MC. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis Rheum 1997; 40: 1725.
  5. Mohan C, Datta SK. Lupus: Key pathogenic mechanisms and contributing factors. Clin Immunol Immunopathol 1995; 77: 209-20.
  6. Bootsma H, Spronk P, Derksen R. Prevention of relapses in systemic lupus erythematosus. Lancet 1995; 345: 1595-9.
  7. Hahn BH. Antibodies to DNA. N Engl J Med 1998; 338: 1359-68.
  8. Smeenk RJT, Hylkema M. Detection of antibodies to DNA: A technical assesment. Mol Biol Reports 1992; 17: 71-9.
  9. von Mühlen CA, Tan EM. Autoantibodies in the diagnosis of systemic rheumatic diseases. Semin Arthritis Rheum 1995; 24: 323-58.
  10. Suárez O, Pividal J, Rivero R, Ramos, Machin R. Preparación de láminas de Crithidia luciliae para el  diagnóstico por inmunofluorescencia del lupus eritematosos sistémico. Rev Cuba Invest Biomed 1988; 8: 140-9.

  11.  

 

Recibido: 10 de enero del 2001.   Aprobado: 22 de febrero del 2001.
Dra. Elena Kokuina. Laboratorios BETERÁ. Calle 102 e/. 31 y 31B. Marianao. Ciudad de La Habana.    Telf. 260-0711 al 14. E-mail: betera@infomed.sld.cu
 

1 Especialista de II Grado en Inmunología. Profesora Asistente.
          2 Licenciada en Biología. Aspirante a Investigadora.
3 Especialista  de II Grado en Reumatología. Profesor Auxiliar.
          4 Especialista de I Grado en Reumatología.
 
 
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